研究建立植物高特異性抵御DNA病毒新方法

　　雙生病毒（Geminiviruses）是存在于植物中唯一一類具有孿生顆粒形態的單鏈DNA病毒，也是目前已知的最大的單鏈DNA病毒家族。據ICTV(International Committee on Taxonomy of Viruses)報道該類病毒目前已增至九個屬，其在單子葉和雙子葉植物中具有廣泛的宿主，對農業生產危害較大。傳統抗病機理的研究主要基于對病毒基因功能的分析及宿主病毒互作機理的解析，但目前在育種中的應用還比較有限。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組先前利用源于細菌中的適應性免疫系統CRISPR/Cas9特異識別切割病毒和外源DNA的特性，以甜菜嚴重曲頂病毒BSCTV（Beet severe curly top virus）為模式病毒，分別選取模式植物本氏煙（Nicotiana benthamiana）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）為寄主材料，在植物中建立了新型、簡易、高效的雙生病毒防御體系(Ji et al， Nat. Plants， 2015)。

　　然而脫靶（即對非目標位點的編輯）是CRISPR/Cas9系統應用于基因治療和分子育種的一大弊端。導致脫靶的發生主要有兩方面因素。第一是sgRNA序列的容錯性。已報道稱在動物細胞中sgRNA的容錯性可高達5個堿基；第二是Cas9蛋白的持續表達易造成對非靶標位點的切割。因而基于過表達CRISPR/Cas9系統的該抗病毒體系很可能對植物基因組發生脫靶修飾。在該研究中，高彩霞研究組以過表達CRISPR/Cas9系統的抗病擬南芥為目標，尋找到高抗病毒靶位點（C3）在擬南芥基因組上的10個潛在脫靶位點（3或4個堿基錯配）。二代測序分析結果表明10個潛在脫靶位點有8個發生了脫靶的修飾。因而雖然過表達CRISPR/Cas9系統能夠對雙生病毒產生高抗性但也易在植物體內的基因組上產生脫靶修飾。因而研究人員利用雙生病毒(BSCTV)自身存在的一類病毒誘導型啟動子，構建了一套新型的病毒誘導型基因組編輯系統VIGE (Virus-inducible genome-editing system)以期避免Cas9的持續表達，從而降低脫靶事件的發生。基于GUS報告系統的結果表明該系統能同步響應BSCTV的激活誘導。且基于本氏煙的瞬時篩選體系和轉基因擬南芥植株皆表明該類病毒誘導型基因組編輯系統能夠被有效激活并抑制BSCTV在寄主植物中的積累。而通過對轉基因擬南芥植株在BSCTV侵染前后的不同組織進行脫靶分析，二代測序結果表明該類系統在轉基因植物體內具有高特異性。鑒于該類病毒誘導型啟動子在雙生病毒基因組中廣泛存在，此方法能夠應用于培育抗病毒植物。

　　該研究成果于11月15日在線發表在Genome Biology 雜志上（DOI：10.1186/s13059-018-1580-4）。高彩霞研究組博士研究生姬祥和司小敏為該文共同第一作者。該研究得到轉基因專項、基金委基礎科學中心以及中科院的資助。