硫酸二甲酯主要經呼吸道、皮膚、消化道吸收進入機體。硫酸二甲酯屬高毒類，臨床作用與芥子氣相似，急性毒性類似光氣，比氯氣大15倍。具有強烈的刺激性和腐蝕性，并有遲發性生物效應。對眼、上呼吸道有強烈刺激作用，對皮膚有強腐蝕作用。可引起結膜充血、水腫、角膜上皮脫落，氣管、支氣管上皮細胞部分壞死，穿破導致縱膈或皮下氣腫。對眼和皮膚有腐蝕作用，皮膚接觸可引起深度壞死和愈合較慢的潰瘍，表現為灼傷，水皰，深度壞死及接觸性過敏性皮炎。 全身癥狀可有衰竭、驚厥、昏迷、麻痹及腎、肝、心等臟器的遲發性病變。硫酸二甲酯為烷化劑，可使核酸烷化而引起遺傳毒性。在細菌致突變試驗、骨髓細胞及中國倉鼠細胞染色體畸變試驗、果蠅伴性隱性致死突變試驗、小鼠淋巴瘤細胞基因突變試驗、肝原代細胞UDS試驗等中都顯示有致突變性。大小鼠于孕期吸入0.1～4 ppm的硫酸二甲酯引起植入前丟失及心血管系統畸形等胚胎毒性。此外，硫酸二甲酯被國際癌癥研究機構（IARC）致癌物分類為2A（人類可疑致癌物）。大鼠吸入和皮下都可誘發局部腫瘤發生，小鼠、倉鼠吸入也可致癌，有研究顯示其具有經胎盤致癌作用。對人的致癌證據尚不充分。
作用機理尚不完全明了，它在體內水解成甲醇和硫酸而引起毒作用，硫酸對眼及呼吸道黏膜產生強烈的刺激和腐蝕作用，與組織中的蛋白質反應，引起接觸面的炎癥和壞死，甲醇吸收入血可引起神經系統毒作用，這已由動物實驗和死亡病例的血液和內臟中檢測甲醇證實。多數學者認為是由于該物質的甲基性質，其對全身及中樞神經的影響可能是對某些重要的酶的甲基化作用有關，對機體組織器官有細胞毒作用，可致腦、心、肝、腎等損傷 。