競爭性RTPCR:競爭子RNA的構建實驗

乙醇雙蒸水DNA 模板[a-32P]ATP

RT-PCR 競爭子構建試劑盒

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

乙醇

去除 RNA 酶的雙蒸水

2. 核酸和寡核苷酸

DNA 模板（0.5~1.0ug 線性化的質粒模板或 0.1~0.5ugPCR 模板）

3. 放射性復合物

[a-32P]ATP(10mCi/ml)(lCi=37 GBq)

4. 實驗器材

RT-PCR 競爭子構建試劑盒（Ambion; 包括 T7RNA 聚合酶、10 倍的轉錄緩沖液、5 倍的 NTP 溶液、MnCl2、DNA 酶 I、凝膠上樣緩沖液、探針洗脫緩沖液）

二、方法

1. 室溫下準備轉錄反應，按下列順序添加試劑。

10 倍的轉錄緩沖液                                     2ul

5 倍的 NTP 溶液                                         4ul

DNA 模板                                                    1~5ul

[a-32P]ATP(10MCi/ml)                                 0.4ul

T7RNA 聚合酶                                             2ul

2. 輕彈管子混勻試劑，簡單離心，收集反應混合物于管底。

3. 37°C 孵育轉錄反應 2~4 h。

4. 從每種樣品中取出1ul, 用于以后的競爭子濃度測定。

5. 在轉錄反應混合物中加入 40ul 探針洗脫緩沖液和 200ul 乙醇。

6. -80°C 孵育 20 min。

7. 4°C 最大轉速離心，沉淀轉錄反應產物。

8. 吸走上清液，用 70% 的乙醇清洗沉淀并在空氣中干燥沉淀。

9. 用 16ul 去除 RNA 酶的雙蒸水溶解沉淀。

10. 95°C 熱變性重懸的沉淀（其中含有 DNA 模板和被轉錄的 RNA)2 min。

11. 加入 2ul10 倍的轉錄緩沖液和 2ul 去除 RNA 酶的 DNA 酶 I(5U/ul)。

12. 輕彈管子混合反應試劑，離心，收集反應混合物于管底。

13. 37°C 孵育 lh。

競爭子的純化

14. 添加 22ul 凝膠上樣緩沖液Ⅱ到 DNA 酶 I 的反應中。

15. 95°C 對樣品進行變性 3 min。

16. 在變性聚丙烯酰胺（6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素）凝膠上跑樣，直到溴酚藍達到凝肢底部。

17. 從凝膠上去掉一個玻璃板，用塑料膜覆蓋凝膠，放上 X 射線片放射自顯彩 30 min~2 h。

18. 顯影 X 射線片并對齊放在凝肢的下面，用解剖刀或剃刀刀片從凝膠上切下全長 RNA轉錄本。

19. 轉移凝肢碎塊到小離心管中。加 300ul 探針洗脫緩沖液，通過簡單離心浸沒碎塊。

20.37°C 孵育過夜。

21. 扔掉管中的丙烯酰胺凝膠碎塊，加入 600ul 乙醇包含 RNA 轉錄本的探針洗脫緩沖液。

22.-80°C 孵育 20 min。

23.4°C 最大轉速離心 15~20 min。

24. 用 70% 乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥。

25. 用 15ul 去除 RNA 酶的雙蒸水溶解沉淀。

競爭子 RNA 定量

26. 轉移 1ul 轉錄反應物和 1ul 純化的競爭子 RNA 到閃爍管中，加入閃爍液，閃爍記數。

27. 使用記數結果，用下面的公式計算出競爭子的濃度（umol/ul 或拷貝/ul)。

競爭子 RNA(umol/L)=(1ul 純化的競爭子 RNA 的 cpm÷1ul 轉錄反應物的 cpm)X(競爭子 RNA 中的 500umol/LATP/A 的總量）
競爭子 RNA(拷貝/ul)=(1ul 純化的競爭子 RNA 的 cpm÷lul 轉錄反應物的 cpm)X(1ul 競爭子 RNA 中 3X10¹⁴ATP 分子/A 的總量）

28. 競爭子應以不小于 6X10¹⁰ 拷貝/ul 或 0.1umol/L 的濃度儲存在-20°C 條件下，保期可達 1 年。