試劑、試劑盒 乙醇雙蒸水DNA 模板[a-32P]ATP
儀器、耗材 RT-PCR 競爭子構建試劑盒
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
乙醇
去除 RNA 酶的雙蒸水
2. 核酸和寡核苷酸
DNA 模板（0.5~1.0ug 線性化的質粒模板或 0.1~0.5ugPCR 模板）
3. 放射性復合物
[a-32P]ATP(10mCi/ml)(lCi=37 GBq)
4. 實驗器材
RT-PCR 競爭子構建試劑盒（Ambion; 包括 T7RNA 聚合酶、10 倍的轉錄緩沖液、5 倍的 NTP 溶液、MnCl2、DNA 酶 I、凝膠上樣緩沖液、探針洗脫緩沖液）
二、方法
1. 室溫下準備轉錄反應，按下列順序添加試劑。
10 倍的轉錄緩沖液 2ul
5 倍的 NTP 溶液 4ul
DNA 模板 1~5ul
[a-32P]ATP(10MCi/ml) 0.4ul
T7RNA 聚合酶 2ul
2. 輕彈管子混勻試劑，簡單離心，收集反應混合物于管底。
3. 37°C 孵育轉錄反應 2~4 h。
4. 從每種樣品中取出1ul, 用于以后的競爭子濃度測定。
5. 在轉錄反應混合物中加入 40ul 探針洗脫緩沖液和 200ul 乙醇。
6. -80°C 孵育 20 min。
7. 4°C 最大轉速離心，沉淀轉錄反應產物。
8. 吸走上清液，用 70% 的乙醇清洗沉淀并在空氣中干燥沉淀。
9. 用 16ul 去除 RNA 酶的雙蒸水溶解沉淀。
10. 95°C 熱變性重懸的沉淀（其中含有 DNA 模板和被轉錄的 RNA)2 min。
11. 加入 2ul10 倍的轉錄緩沖液和 2ul 去除 RNA 酶的 DNA 酶 I(5U/ul)。
12. 輕彈管子混合反應試劑，離心，收集反應混合物于管底。
13. 37°C 孵育 lh。
競爭子的純化
14. 添加 22ul 凝膠上樣緩沖液Ⅱ到 DNA 酶 I 的反應中。
15. 95°C 對樣品進行變性 3 min。
16. 在變性聚丙烯酰胺（6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素）凝膠上跑樣，直到溴酚藍達到凝肢底部。
17. 從凝膠上去掉一個玻璃板，用塑料膜覆蓋凝膠，放上 X 射線片放射自顯彩 30 min~2 h。
18. 顯影 X 射線片并對齊放在凝肢的下面，用解剖刀或剃刀刀片從凝膠上切下全長 RNA轉錄本。
19. 轉移凝肢碎塊到小離心管中。加 300ul 探針洗脫緩沖液，通過簡單離心浸沒碎塊。
20.37°C 孵育過夜。
21. 扔掉管中的丙烯酰胺凝膠碎塊，加入 600ul 乙醇包含 RNA 轉錄本的探針洗脫緩沖液。
22.-80°C 孵育 20 min。
23.4°C 最大轉速離心 15~20 min。
24. 用 70% 乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥。
25. 用 15ul 去除 RNA 酶的雙蒸水溶解沉淀。
競爭子 RNA 定量
26. 轉移 1ul 轉錄反應物和 1ul 純化的競爭子 RNA 到閃爍管中，加入閃爍液，閃爍記數。
27. 使用記數結果，用下面的公式計算出競爭子的濃度（umol/ul 或拷貝/ul)。
競爭子 RNA(umol/L)=(1ul 純化的競爭子 RNA 的 cpm÷1ul 轉錄反應物的 cpm)X(競爭子 RNA 中的 500umol/LATP/A 的總量）
競爭子 RNA(拷貝/ul)=(1ul 純化的競爭子 RNA 的 cpm÷lul 轉錄反應物的 cpm)X(1ul 競爭子 RNA 中 3X1014ATP 分子/A 的總量）
28. 競爭子應以不小于 6X1010 拷貝/ul 或 0.1umol/L 的濃度儲存在-20°C 條件下，保期可達 1 年。