1、底物濃度對酶促反應速度的影響
當底物濃度很低時，有多余的酶沒與底物結合，隨著底物濃度的增加，中間絡合物的濃度不斷增高。
當底物濃度較高時，液中的酶全部與底物結合成中間產物，雖增加底物濃度也不會有更多的中間產物生成。
2、溫度對酶反應速度的影響
一方面是溫度升高，酶促反應速度加快。另一方面，溫度升高，酶的高級結構將發生變化或變性，導致酶活性降低甚至喪失。因此大多數酶都有一個最適溫度。在最適溫度條件下，反應速度最大。
3、pH值對酶反應速度的影響
酶促反應速度受介質pH的影響，一種酶在幾種pH介質中測其活力，可看到在某一pH時酶促效率最高，這個pH稱為該酶的最適pH。酶作用存在最適pH提示酶分子活性基團的電離狀態、底物分子及輔酶與輔基的電離狀態都與酶的催化作用相關，但酶的最適pH也不是酶的特征性常數，如緩沖液的種類與濃度，底物濃度等均可改變酶作用的最適pH。
4、激活劑對酶反應速度的影響
凡能提高酶活性的物質，都稱為激活劑。
(1)無機離子：金屬離子(K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+)陰離子(Cl-、Br-)、氫離子。
(2)中等大小的有機分子：某些還原劑、乙二胺四乙酸(EDTA)
5、抑制劑對酶作用的影響
使酶的必需基團或活性部位中的基團的化學性質改變而降低酶活力甚至使酶失活的物質，稱為抑制劑。
(1)不可逆抑制作用：抑制劑與酶的結合(共價鍵)是不可逆反應，抑制劑與酶結合后不能用透析等方法除去抑制劑而恢復酶活性。如二異丙基氟磷酸對胰凝乳蛋白酶或乙酰膽堿酯酶；碘乙酸、碘乙酰胺、對一氯汞苯甲酸對巰基酶。
(2)可逆抑制作用：抑制劑與酶的結合是可逆反應，用透析等方法能除去抑制劑使酶恢復活力。又可分為競爭性抑制作用和非競爭性抑制作用。
競爭性抑制作用是指有些抑制劑和底物結構極為相似，可和底物競爭與酶結合，當抑制劑與酶結合后，就妨礙了底物與酶的結合，減少了酶的作用機會，因而降低了酶的活力。它的特征是，當加大底物濃度時，底物和酶結合的幾率增大，減少了抑制劑與酶的結合，抑制作用便會減弱。
非競爭性抑制作用是指有些抑制劑和底物可同時結合在酶的不同部位上，即抑制劑與酶結合后，不妨礙再與底物結合，但所形成的酶一底物一抑制劑三元復合物(ESI)不能發生反應。高濃度的底物不能使這種抑制作用逆轉。