類器官熒光染色實驗流程（一）

固定

注意: 合并2-3孔的幾十個類器官最為理想，但也可只使用一個孔的類器官。

使用PFA固定和O.C.T包埋的實驗流程

使用1.5 mL的EP管收集類器官，使用4% PFA溶液室溫固定半小時。室溫下用PBS清洗3次，每次5分鐘。然后將樣本轉移至30% 蔗糖溶液4度孵育過夜。第二天，移除蔗糖溶液，在O.C.T中孵育15分鐘。將類器官轉移至組織模具中，置于-20度，繼續在O.C.T中進行包埋。可于-80度儲存或進行冷凍切片。

使用福爾馬林固定和瓊脂糖包埋的實驗流程

1. 從孔板中吸出培養基。加入1 mL的福爾馬林。

2. 使用1 mL的槍頭輕柔地重懸類器官和基質膠，將混合物轉移至EP管中。將所需的所有孔的類器官加入同一EP管中。（也可以在孔板中進行固定，一起重懸）

3. 輕輕混合，放在冰上孵育至少一個小時。

4. 4度，1500 rpm，離心5分鐘。

5. 小心地吸出福爾馬林。

6. 用冰冷的PBS清洗，4度，1500 rpm，離心5分鐘，小心吸出PBS。重復至少兩次。（為了幫助去除Matrigel，也可加入Cell recovery medium，冰上孵育15-30分鐘）

7. 使用冷的福爾馬林重懸將類器官，4度孵育過夜。

注意：染色方面，類器官切片的處理方式與其他組織切片一樣，使用一般脫蠟，補液，抗原修復等的常規步驟。

hPSC-Derived Intestinal Organoid, EPCAM (Green), KRT20 (Red), Desmin (White), DAPI (Blue)

8. 準備模具：準備1條8-strip PCR管，分成單個管，切掉管的下半部分，得到一個圓環作為模具。將模具放到培養皿中，使其與底部平齊，然后放在冰上。

9. 使用福爾馬林輕柔的混合類器官，4度，1500 rpm離心5分鐘。輕輕吸出福爾馬林，不要接觸到沉淀的類器官。如果觀測到成塊的基質膠，可使用BD cell recovery medium冰上孵育30分鐘。再次離心，盡量吸出所有的液體。

10. 使用無菌的PBS配制3% 低融點的瓊脂糖。使用微波爐加熱至完全融化。

11. 趁瓊脂糖溶液還保持溫熱的液體狀態時，使用75 μL的瓊脂糖液體輕柔地重懸類器官。如果使用 200 μL或更小的槍頭，剪掉槍頭尾部，防止損傷類器官。

12. 立即將重懸后的類器官和瓊脂糖液體轉移入冰上放置的培養皿中的模具中。瓊脂糖會立即固化。第11步和第12步一定要完成的越快越好（15秒以內），否則瓊脂糖會在槍頭中固化，造成樣本的損失。避免引入氣泡，但少量的氣泡可能無法避免。

13. 在倒置顯微鏡檢查瓊脂糖包埋的類器官的數量，質量和位置。

14. 在4度孵育1個小時以上，確保瓊脂糖固化完成。

15. 從模具中取出，轉移到組織盒中，使用70% 乙醇儲存。

hPSC-Derived Hindgut Spheroid, EPCAM (Green), CDX2 (Red), E-Cad (white), DAPI (Blue)

補液，抗原修復和染色

補液（Rehydration）

1. 把切片放入接近沸騰的熱水中加熱11分鐘。（切片應放入切片盒內，且保持干燥。）

2. 使用組織級別的二甲苯里清洗2分鐘。重復4遍。

3. 使用100% 乙醇清洗5分鐘。重復2遍。

4. 使用90% 乙醇清洗5分鐘。

5. 使用70% 乙醇里清洗5分鐘。

6. 使用dH2O清洗5分鐘。

注意：

- 免疫熒光染色（Immunofluorescent staining ），請繼續進行第7-18 步

- H&E 染色（H&E staining ），請繼續進行第19-24步

- 阿爾新藍染色（ Alcian Blue staining），請繼續進行第25-32步。

抗原修復

7. 將切片放入密封的切片盒中。使用微波爐將檸檬酸鹽緩沖液（10 mM 檸檬酸鈉，0.05% tween-20，pH 6.0）加熱至沸騰。用緩沖液加滿切片盒，沒過所有的切片。

8. 將放有切片的切片盒和緩沖液置于蒸器中30分鐘。（需要保持溫度接近沸點，而不要到達沸點。）

9. 將切片從檸檬酸鈉緩沖液中取出，短暫降溫，然后用PBS緩沖液清洗2分鐘。