1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；
2、取對數生長期的細胞，去除舊培養液，用PBS清洗。
3、去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養皿表面）把單層生長的細胞消化下來；
4、離心1000rpm，5min；
5、去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
6、細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；
7、在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
8、凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。