蛋白質所帶電荷取決于它的等電點（PI）和層析柱中的PH值。當柱中的PH低于蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離于交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高于其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，并與陰離子交換劑結合。由于洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低于PI時，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，于是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點排列的。