（1）制片技術：肌肉的組織化學染色主要是測定肌肉中各種酶的含量，由于石蠟切片的處理過程中常將肌肉中的酶破壞，故已被淘汰。主要用液氮快速冷凍法。
首先將肌肉標本縱向垂直種植在一小軟木片上，放置時應注意肌纖維的方向，周圍用黃耆膠固定，露出肌肉上端。然后將盛有異戊烷的燒杯放入液氮容器（保溫瓶）中，當燒杯底部異戊烷形成白色粘稠狀時，表明溫度已降至－160℃，用長鑷夾住肌肉標本浸入異戊烷快速冷凍，此過程約10～20秒。冷凍后將肌肉標本置于超低溫冰箱儲存。
冰凍過程是肌肉活檢的關鍵步驟，肌肉組織中水分含量高，制片過程中易出現冰晶，給診斷造成困難。異戊烷間接制冷則可以防止液氮在肌肉表面形成氣泡影響制冷速度，避免在肌纖維內形成冰晶偽差。如異戊烷短缺也可直接投入液氮中。
在恒冷箱式冰凍切片機（－20℃）條件下切片，厚度8～10μm左右，免疫組化為5μm。
（2）染色方法：組織化學技術是在組織切片上通過分解、置換、氧化、還原等化學變化，經呈色反應顯示組織細胞內的化學成分，對肌纖維的代謝產物和酶活性進行定位。染色方法很多，一般根據臨床及HE的結果而增加。常規應包括HE染色、Gomori染色、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶（NADH-TR）染色、PAS染色、蘇丹黑或油紅O染色及ATP酶染色等。
①HE染色：HE（haematoxylin-eosin，HE蘇木素-伊紅）染色在組織學上是一種應用最廣泛的染色方法，通過HE染色可清楚地觀察到各種不同的組織結構，并為其他染色提供佐證。正常細胞核染成淡藍色，細胞漿染成紅色。
②Gomori三色染色：此染色主要用來檢測橫紋肌肌漿內的線粒體，當線粒體肌病患者的橫紋肌肌漿內有大量線粒體異常堆積，異常線粒體多聚集在肌膜下，經Gomori三色染色被染成紅色稱“破碎紅纖維”（ragged-red fiber，RRF）。肌原纖維呈暗綠色，結締組織亮綠色，肌核紫紅色，肌膜和線粒體呈紅色。
③PAS染色：PAS（periodic-acid schiff stain，PAS）染色原理是肌糖原經過碘酸氧化，使1，2二醇基形成雙醛，再與Schiff試劑作用生成紫紅色沉淀。主要用來診斷糖原累積病。值得注意的是本反應無特異性，除肌糖原外，其他多糖、中性粘多糖、糖蛋白、糖脂等均可呈陽性反應。因此，染色時應有對照。
正常細胞核呈藍色，肌原纖維間的肌質網呈紅色或紫紅色，Ⅱ型纖維深于Ⅰ型纖維。
④油紅O與蘇丹黑染色：油紅O與蘇丹黑均為脂溶性染料，溶于有機溶劑中制成飽和溶液，當組織切片置于其內時，染料分子進入細胞內使組織中脂類著色。蘇丹黑與大多數脂類結合，油紅O易與甘油三酯結合。
油紅染色肌質網內有橙紅色脂滴，細胞核染成藍色，Ⅰ型纖維脂滴多，Ⅱ型纖維脂滴少。蘇丹黑染色肌質網內有黑色脂滴，核染成紅色，Ⅰ型纖維深于Ⅱ型纖維。
⑤非特異酯酶染色：非特異酯酶（non-specific eslerase，NSE）主要定位在內質網、溶酶體，利用α-醋酸萘酯為底物，經偶聯反應形成棕紅色沉淀，酶活性的部位顯示棕紅色，可顯示運動終板的病變。用于重癥肌無力等疾病的診斷。
酶活性部位呈棕紅色，Ⅰ型纖維重于Ⅱ型纖維。
⑥ATP酶（三磷酸腺苷酶）染色：ATP酶染色為重要的染色，可用于區分肌纖維類型。ATP酶與肌球蛋白分子結合并受鈣離子所調節。染色時ATP酶先被鈣離子激活，再經氯化鈷置換鈣離子，形成硫化鈷黑色沉淀，有ATP酶活性的肌纖維被染成黑色。
將肌組織切片事先在不同氫離子濃度的液體內孵育，可以抑制某一型肌纖維的ATP酶活性。如堿性環境中抑制Ⅰ肌纖維ATP酶活性，因此經堿性孵育液孵育，Ⅱ型纖維著色深，Ⅰ型纖維無色。而酸性環境抑制Ⅱ型肌纖維的ATP酶活性，經酸性孵育液孵育后，Ⅰ型纖維著色最深，Ⅱ型纖維無色，要求孵育液的pH值一定要測量準確，相差0.1即影響結果（表1）。
⑦NADH-TR染色：NADH-TR（還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶，NADH-tetrazolium raductase）為有氧代謝電子傳遞鏈中的一個酶，定位于線粒體和肌質網。反映三羧酸循環細胞色素系統和其他氧化代謝途徑的利用情況。本染色原理以NADH為底物，無色的四唑鹽作為受電子體并被還原成藍紫色的不溶性甲quan，甲quan沉淀于酶活性部位。本染色反映的是三羧酸循環細胞色素系統和其他氧化代謝途徑的情況。
肌質網和線粒體染成藍紫色，肌原纖維無色，Ⅰ型纖維著色深于Ⅱ型纖維，Ⅰ型纖維染成藍紫色，Ⅱ型纖維染成淡灰色。本染色的優點是能顯示肌原纖維的內部結構。
⑧酸性磷酸酶染色：酸性磷酸酶（ACP）主要定位于溶酶體內，內質網和胞漿內也可見有其活性，本染色以萘酚AS-BI磷酸酯為底物，經酶水解釋放出萘酚AS-BI，然后與重氮鹽偶聯形成紅色產物。
酶活性部位呈紅色，核呈綠色，正常肌纖維此酶陰性，炎性或退變等病理性肌纖維呈陽性。可證明炎性細胞、壞死肌纖維酸性麥芽糖酶缺陷。
⑨磷酸化酶染色：磷酸化酶（phosphoryl，PPL）為糖原酵解的限速酶，主要位于內質網上，可將糖原分子中葡糖基1.4鍵斷裂。染色原理是以G-1-P為底物，使其合成糖原，然后以Lugol碘液顯色，6個葡糖基以下不顯色，8～12個葡糖基直鏈顯紅色，30～50個葡糖基顯藍色。為糖原累積病（McArdle）的特異性診斷。
酶活性部位呈灰至藍色，Ⅰ型纖維呈灰色，Ⅱ型纖維呈棕藍色，正常Ⅱ型纖維著色強于Ⅰ型纖維，如呈淺黃色為陰性，但一定要對照，及時觀察。