膠體金標記蛋白A技術（Protein A-gold technique, PAg法）
PAg復合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白。PAg 復合物與包埋劑和細胞成分都極少發生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結合特性既不影響蛋白A的活性，又能保持高度的穩定性，PAg復合物分子最小易于穿透組織。PAg復合物的原液在4℃可保存達一年之久。電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術的應用原則是二步標記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區別于一般膠體金免疫染色在：①須1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris緩沖液（pH7.4）來封閉非特異性的結合部位，而不是采用羊或其它的動物的正常抗血清，因為PAg復合物能夠與正常血清組中的Ig結合，從而給出假陽性結果；②在應用第一抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復合物孵育前的準備時，應用的PBS或TBS的pH應變更為pH8.2。其它可參照本節中包埋后染色法進行。
液體配制：
1、 膠體金稀釋液配方：
（PH＝8.2）的0.02mo1／L Tris TBS緩沖液，加入試劑級卵清白蛋白至1％。｛免疫電鏡按1：20-50稀釋，淡紅色為適宜稀釋液,膠體金稀釋后應于當天使用，未用完的應該丟棄。（免疫膠體金說明書）｝
2、 清洗液：
0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl約420m1，調pH值至7.4，最后加雙蒸水至1000m1，此為儲備液。
0.05mo1／L Tris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1；加雙蒸水至1000m1，調pH值至7.4。
0.02mo1／LTris緩沖生理鹽水：氯化鈉8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1，加雙蒸水至l000m1，調pH值至8.2。
3、 H2O2的配制:3% H2O2
4、 8％過碘酸鈉水溶液
5、 封閉液：
前封閉液：1%卵白蛋白—0.05mo1／LTris緩沖液（pH7.4）；
后封閉液以及膠體金稀釋液：1%卵白蛋白—0.02mo1／LTris緩沖液（pH8.2），后封閉為膠體金結合作準備。
具體操作:
一、包埋：常規電鏡制樣，樣品只需要戊二醛固定，不需要鋨酸后固定。丙酮梯度脫水時70％的丙酮中沒有添加染色劑。樣品于37度烘箱中固化。
二、切片：
超薄切片厚50～70nm左右，載于300網孔的鎳網上。
三、抗原修復：
1、置1%H2O2內10min至1h（視樹脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經系統切片，有主張以1%過碘酸鉀（KIO4）代替H2O2的。
（同時用8％過碘酸鈉水溶液代替雙氧水，室溫5～25分鐘以及丙酮對環氧樹脂進行溶解。看三者那個效果最好）
2、雙蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛雙蒸水的注射器沿鎳網面沖洗，水流應有適當壓力，但不宜過高強，用濾紙在網緣將水吸干。(0.05mo1／L TBS pH7.4洗5min×3次?)
三、封閉以及免疫反應：
1、載有超薄片的鎳網或金網浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室溫約1h，阻斷非特異性吸附，吸去多余血清，不洗。
2、載網直接移至第一抗血清液滴上(抗體稀釋度較常規免疫組化低l倍)，在室溫孵育2h或4℃18～24h。
3、0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。1％卵清白蛋白0.02mo1／L TBS（8.2） 37℃孵育l h，再次阻斷非特異性吸附，吸去多余液體，不洗。
4、將PAg原液稀釋10～20倍（1：30～1：100，淡紅色為適宜稀釋液），載網浮于該液滴上，室溫孵育10min至1h（37℃孵育2h？）。
5、0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。最后切片浸于0.05m01／L TBS pH7.4緩沖液中，送電鏡室處理（含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分鐘？）。
四、電子染色以及電鏡觀察：
1、5%醋酸鈾（雙蒸水配制）染5min，然后用雙蒸水洗。
2、枸櫞酸鈾（或醋酸鉛）染色5min，雙蒸水洗凈。
3、H－600透射電鏡觀察。
免疫膠體金試驗成功的要求：
抗體高度特異性和親和力以及被檢組織內抗原含量高；標本的前處理和染色也至關重要。
取消鋨酸后固定，聚合溫度不宜高于45度，可以選用37度12小時，45度48小時作為聚合溫度。試驗全過程應保持網面的濕潤。緩沖液要清潔，最好用新鮮配制的或經微孔濾紙過濾后使用。
染色前所用器皿必須清潔干凈且專用，并用雙蒸水沖洗三遍，染色程序中的洗滌必須充分，以減少背景染色。尤其雙重免疫標記的切片染色時，第一次金標二抗孵育后必須充分洗滌，以不影響第二次金標二抗的反應結果。摘自:賈云香,卓夏陽,顧云娣.雙重膠體金標記的免疫電鏡技術.江西醫學院學報,2003,43(4):22-24
將免疫組織化學技術與電子顯微鏡技術相結合，則可以利用電子顯微鏡高分辨率的優點，在超顯微結構水平定位細腦內的特異性抗原。為疾病的病因、發病機理、組織來源等方面的探索研究，為提高疾病的認識與診斷提供可靠的手段。
1) 試劑配制：