自動白細胞分類計數的技術現狀和展望

    胡曉波，上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院檢驗科主任，副主任技師。1993年畢業于上海第二醫科大學，并留校任醫學檢驗系教師。1999年至上海市臨床檢驗中心，擔任中心副主任，負責業務和部分行政管理工作。2006年至上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院檢驗科工作，擔任科副主任、主任，負責業務和部分行政管理工作。研究方向：臨床檢驗基礎的臨床實踐和質量管理。發表論文幾十篇，參編和主編書籍幾十本。任中華醫學會檢驗分會血液體液學組委員，醫學實驗室認可評審員，《檢驗醫學》、《中國實驗診斷學》、《診斷學理論與實踐雜志》編委。

      隨著細胞計數技術實現自動化后，1970年代對白細胞分類計數的自動化需求也隨之增加，先后有兩種不同的技術被引入該領域，其一為基于顯微鏡的自動方法，采用自動影像分析技術直接識別和分析染色的血涂片上白細胞；其二為所謂流式系統（flow system），基于自動細胞計數的原理，對白細胞做特殊染色后進行分類計數。

一、自動白細胞分類計數歷史

      最早實現細胞分類自動化的是影像處理技術。1952年，建立巴氏染色（Pap stain）技術的Papanicolaou開始著手研究自動宮頸涂片篩查儀。他和Mellors發現，單位面積下癌細胞發出的熒光常超出正常細胞，基于此，他們制造了一臺光電掃描儀，用于自動測定核熒光信號。但是，采用單一參數不能很好鑒別宮頸癌細胞，因此該儀器未能得到推廣研究。1950年代末到1960年代初，美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）資助了細胞學分析儀項目，以期實現宮頸涂片異常細胞的自動篩檢，是對宮頸涂片掃描后，測量細胞核大小和核密度兩個參數，然后進行分類。但是，該儀器不能判斷密度大的區域是宮頸癌細胞的核，還是成堆的白細胞和其他成堆的細胞。

      在1960年末到1970年初，Ingram、Preston、Young和Bacus等分別開始研究影像法白細胞自動分類。1973年，按法則規定需將正常白細胞至少分成6類，包括中性粒細胞分葉核和桿狀核、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。因快速、常規和可靠的需求，自動白細胞分類儀開始進入臨床檢驗領域。1972年，Larc首先在國際血液學大會上報道了應用康寧玻璃制作的自動白細胞分類計數儀。1974年Geometric Data公司和Coulter公司，1978年Abbott公司分別制造了基于影像技術的Hematrak、Diff-3和ADC 500儀器。盡管這些儀器可用于成熟白細胞的亞分類，并能提供紅細胞形態學定性參數信息和異常有核細胞的信息。但是，這些自動白細胞分類儀價格昂貴，缺點不少，未能在臨床廣泛使用。

      隨著多參數細胞計數儀在臨床上常規使用，一方面，實現了自動進樣到結果自動報告的全自動化，無需顯微鏡計數細胞；另一方面，昂貴的影像處理儀僅實現了染色血涂片的自動化顯微鏡檢查過程，相對處理速度較慢，多數血涂片仍需形態學專家的進一步幫助。基于當時計算機速度和技術的局限性，自動化白細胞分類系統仍有許多缺陷，如血涂片制作和染色仍需手工操作、實驗室信息系統不完善，結果必須手工錄入。近年，因計算機硬件和軟件的飛速發展，自動影像處理系統再次引起了人們的興趣，采用神經網絡技術，大大提高了人工智能識別能力，如CellaVison系統。

      與自動影像處理系統平行發展的另一種自動白細胞分類方法，是基于酶細胞化學的方法，在光學法在細胞計數時能自動分類白細胞。該法首先由Technicon和Mount Sinai醫學院合作建立。1974年，Mount Sinai醫學院的Ornstein和Ansley建立并報道了應用連續流動技術，使用細胞化學染色法對白細胞進行分類計數。第一代自動白細胞分類儀是1974年Technicon的Hemalog-D，該系統采用3個平行通道對白細胞進行分類，其中，第1通道，用4-氯-1-萘酚染色含髓過氧化物酶的細胞，按細胞染色和大小，將白細胞分為淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞；第2通道，在特定pH條件下，用非特異性酯酶對細胞進行染色，以識別單核細胞；第3通道，采用Alcian藍染色，對嗜堿性粒細胞進行分類。Hemalog-D系統已實現了自動化分析和處理白細胞的能力，在每個通道中計數10000白細胞，并進行分類，計數結果具有高精密度。

      與自動影像分析技術類似，流式分析系統也有局限性。雖然，這類儀器在很大程度上實現了自動化，但是，其優點也并非能勝過價格，許多標本仍需進一步顯微鏡檢查以識別紅細胞形態和異常細胞形態，而且采用連續流動技術的設備必須定期校準。

      Technicon將Hemalog-D和Hemalog-8兩個系統合并，形成了第一代的多參數血細胞分析系統（multiparameter cell counting system）。隨后，具有相似特點的多種血液分析儀也很快問世。如1989年Coulter公司的STKS分析儀，1991年較小型的MAXM分析儀；1989年Sysmex公司的NE-800系統，采用3個獨立通道進行白細胞分類計數；1980年年代末期的Abbott公司的CellDyn系列多參數分析儀，采用偏振光進行白細胞分類計數；1990年代早期Horiba ABX公司的多參數系統也面世使用。

二、自動白細胞分類技術進展

1.自動顯微鏡法

      手工白細胞分類計數的主要缺點是效率低下。在2000年左右，新一代自動顯微鏡分析儀出現（如CellaVision DM8和DM96)，大大提高了白細胞分類的速度和精度。在涂片制作和染色實現自動化后，這些稱為自動數字化細胞形態學系統（automated digital cell morphology systems），能準確定位和數字化細胞，并按軟件設計預分類細胞，將數據貯存在擴展數據庫中。與CLSI推薦的操作方法相比，儀器的涂片讀取速率是35張/h，還能同時對紅細胞和血小板的形態進行分析。與形態學術語比較，將白細胞預分類為中性分葉核粒細胞、中性桿狀核粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、原始細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞、異形淋巴細胞、漿細胞和未分類細胞。近年研究表明，對于正常白細胞亞群，DM96預分類結果與手工法相關性良好；對于異常亞群白細胞，相關性不好，需要進一步手工分類，多數用戶認為自動化方法具有較高的效率。盡管自動化形態學分析儀具有高效率，但所有異常的結果仍需重新進行手工白細胞分類，特別是低白細胞數，且操作人員需要良好的培訓，此類儀器也不能提供新的分類參數。

      總之，隨著計算機智能化發展，細胞影像數字化是傳統細胞形態學分析的革命。但是，不能提供白細胞分類的新概念和新參數。

2. 免疫表型法

      許多方法可用于免疫表型白細胞分類（immunophenotypic leukocyte differential，ILD），如經典血液分析儀法和流式細胞儀法。但是，目前形態學白細胞分類（morphologic leukocyte differentiation，MLD）仍是白細胞分類的參考方法，大多數ILD血液分析儀采用此參考方法進行評估。

      （1）血液分析儀法：Abbott的Cell-Dyn 4000是首先在經典血液分析儀上采用三色流式細胞術進行白細胞分類計數。Sapphire的自動平臺也采用同樣的原理，多參數分析三色結果，采用3種熒光染料（如綠色異硫氰酸熒光素（FITC）、橘黃色藻紅蛋白（PE）、紅色藻紅蛋白+青藍5（Cy5））與各種單克隆抗體結合使用。缺點是參數標準化不足、軟件專用于ILD。

      （2）流式細胞儀法：目前，免疫表型法白細胞分類僅是一個概念問題。與血液分析儀法原理類似，流式細胞儀首先采用激光照射液流中的細胞，得到細胞大小（前向散射光，FSC）和顆粒（側向散射光，SSC）信息，可初步將白細胞亞群分為粒細胞、單核細胞和小細胞團（較粒細胞小，可能是淋巴細胞和原始細胞）。

      隨后，采用最廣泛的免疫表型參數CD45進行染色，形成CD45和SSC圖形，其中，粒細胞為高SSC、中CD45，單核細胞為中SSC、高CD45，淋巴細胞為低SSC、高CD45，原紅細胞為低SSC、低CD45，幼稚細胞為低SSC、中CD45。通過萬能4組合（CD11b/CD14/CD16/CD45）也可定義成熟粒細胞（CD11b+/CD16+）和成熟單核細胞（CD11b+/CD14+）陽性群體。

      對于SSC/CD45散點圖來說，在流式細胞儀上應用最廣的設門軟件是顏色設門（gate-coloring），此參考圖形（reference map）可作為任何比例細胞的背景設門（back-gating）方法。最經典應用是法國GTLLF（Groupe de Travail sur les Leucemies et Lymphomas Francophone）工作組對正常骨髓細胞成熟過程的描述。該工作組推薦12種免疫表型組合（見附表）以鑒別正常骨髓細胞，通常采用3種單抗+CD45抗體的組合方式，以萬能4色組合鑒別正常骨髓中各類成熟細胞系。其中，第1組能鑒別3系大多數成熟細胞；第2組能提供粒細胞成熟路徑，主要為幼稚細胞表達CD34+，過度期表達CD117，成熟期表達CD11b，多為中性分葉核粒細胞；第3組能鑒別原紅細胞（CD36和CD71）和成熟單核細胞（CD11c和CD36）；第4組能提供幼稚粒細胞（CD34+）至成熟單核細胞（高CD45、CD33+/CD13+）成熟路徑，粒細胞成熟路徑由CD34+多能干細胞到CD33+/CD13-、CD33-/CD13+至CD33-/CD13-中性分葉核粒細胞；第5組為單核細胞成熟路徑和成熟CD38+/DR-細胞，以及成熟淋巴細胞和CD34+/CD38-、CD34-/CD38+造血細胞，并逐步表達CD45的過程；第6組為成熟B淋巴細胞，表達CD19；第7組為大多數幼稚階段全能細胞和早期分化髓細胞；第8組為成熟淋巴細胞和分化的NK細胞；第9組為成熟B淋巴細胞（CD10和CD24）、成熟粒細胞（表達CD10和CD24，不表達CD64）和單核細胞（CD64+）；第10組為伴CD7的分化T細胞；第11和12組為成熟淋巴細胞亞群的終末階段。

      上述適用于正常骨髓細胞的免疫表型分析，有助于了解造血過程中細胞成熟的順序。而外周血細胞分類的免疫表型分析方法更復雜，不僅需要針對正常個體，而且還需要檢出病理情況。

      近10年來，新的血液分析儀更是具備了檢測和計數異常細胞的能力，如有核紅細胞和幼稚粒細胞。血小板計數已有基于免疫學的分析方法，如Abbott的免疫法血小板計數。總之，基于免疫學的多參數流式細胞術血液分析儀將是白細胞計數和分類的最佳標準，不僅是能夠分析更多數量的細胞（>104)，而且能用于血液病的診斷和隨訪，如最小殘留病的檢測。免疫表型分類方法最有可能替代傳統的光學法，不僅是因為更精確的對異常白細胞亞群的計數和定義，而且很容易用粒子懸液（bead suspensions）對儀器進行校準，如FlowCheck。

三、參考方法

      參考方法主要用于確認自動化血液分析系統的準確性。目前，常采用與常規手工操作類似的方法，但對低值細胞的計數精度不佳。尚在建立和完善的參考方法是采用特定單抗標記特定細胞（包括幼稚細胞）的流式細胞術法，目前，該法已能用于原始細胞、異形淋巴細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和有核紅細胞檢測。

1.顯微鏡法

      白細胞分類概念源自顯微鏡下細胞的形態學檢查，似乎其本質就是形態學參考方法。歷史上，1977年美國病理學會（CAP）召開會議，討論如何評價自動白細胞分類儀的結果，1984年國際血液學標準委員會（ICSH）推薦了1981年美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）起草的白細胞計數參考方法（H20-P），1992年批準文件為H20-A ， 2007年臨床實驗室和標準委員會（CLSI）修訂文件為H20-A2。建立了參考方法后，新的白細胞分類儀在美國食品藥品監督管理局（FDA）的管理要求從2001年開始由Ⅲ類降為Ⅱ類，僅需廠商提交510（K）文件，這是1998年國際實驗血液學會（ISLH）工作組努力的結果。目前，ISLH工作組和CLSI合作，正在建立擴展白細胞分類計數的新參考方法，以檢測和報告有核紅細胞、異形淋巴細胞、原始細胞和幼稚粒細胞。

      如前所述，白細胞分類建立參考方法為了提高結果精密度和復現性，通常是對同一份標本制作至少2張血涂片并進行染色，由2位檢驗人員在顯微鏡下分別計數200個白細胞，要求首先在低倍鏡下（×10）觀察整張血涂片，獲得其質量的第一印象，尋找紅細胞分布均勻的區域，在油鏡下（×100）觀察細胞的具體結構，此時應注意白細胞數量多少的估計、異常細胞的發現、血小板相對數量多少的估計，以及異常血小板的發現。血涂片檢查應避免3類誤差，包括涂片分布誤差和分類計數區域誤差、白細胞計數統計誤差和觀察者誤差。雖然，目前認為白細胞分類顯微鏡參考方法是最準確方法，但是，耗時且需要有經驗操作人員，不適合日常工作。

2.免疫法

      在血液學領域中，新白細胞分類參考方法將不再考慮基于形態學的分類，如前所述的形態學分類的局限性，ICSH新執行委員會正考慮建立白細胞分類的免疫學新參考方法。推薦的參考方法應具有直接檢測和計數細胞的能力，要求在總有核細胞少（5個細胞/μl）、細胞頻率低（>0.1%）的情況下，檢測結果的變異系數應<5%，特別是中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，同樣，也能用于幼稚髓細胞、原始細胞、有核紅細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞和NK細胞的檢測。

      2007年，此研究方向取得了一定的進展，Beckman Coulter公司稱之為Hematoflow的儀器問世。該儀器是采用單管/5色/6種抗體方案，即CD36/CD2/CRTH2/CD19/CD16/CD45組合，能鑒別外周血12種細胞的亞群。其中，經典的CD45/SSC用于定位白細胞群體，并通過背景設門和顏色核查來確定各亞群的位置。CD36用于鑒別單核細胞和幼稚紅細胞。CD2+/高CD45+細胞代表T淋巴細胞和NK細胞，CRTH2+/中CD45/低SSC代表嗜堿性粒細胞。CD2和CD16更精確的識別細胞毒NK細胞。CD19表示幼稚和成熟B細胞，用CD45表達來鑒別。部分高SSC細胞CD16+代表幼稚中性粒細胞、嗜酸性粒細胞（均陰性），成熟中性粒細胞（CD16+）。嗜酸性粒細胞進一步鑒別標志是CRTH2表達。在外周血中，中CD45/低SSC群體可能是原始細胞，進一步精確的判斷需其他組合。儀器的專用軟件能快速和精確的對外周血細胞進行分類，定位常見細胞亞群。雖然，正常標本借助形態學即能判別，無需應用此方案，但是，此方案與傳統形態學相比具有更全面和優越的特點，能計數和分類血細胞的亞群。同樣，此組合也能用于髓細胞白血病中異常原始髓細胞的分類，如毛細胞淋巴瘤患者的CD19會表達增加、近期感染者的幼稚粒細胞數量會增加等。

      同樣的單抗組合和基于陰性設門的專門軟件，還能進一步提高正常和異常標本的鑒別能力。其分離細胞亞群的設門策略為：

      1）B淋巴細胞用CD19/SSC散點圖識別；

      2）白細胞表達CD45，以排除非白細胞；

      3）幼稚中性粒細胞表達CD16和CD45；

      4）共同表達CD36、CD2+/CRTH2代表為單核細胞；

      5）和6）CD16表達/SSC散點圖用于鑒別幼稚粒細胞和嗜酸性粒細胞，高SSC和CD16表達為NK細胞；

      7）其余T細胞用CD45/SSC散點圖左側區域識別；

      8）和9）剔除嗜堿性粒細胞和清空設門后，所顯示的細胞為原始T淋巴細胞和原始髓細胞，按此策略，其他細胞亞群經軟件處理后在不同步驟中均能得出。必須強調的是，此方案最大優點是采用復雜的軟件設門，比使用更多顏色熒光和單抗更為重要。

      最近，也有提出采用5色/7種單抗，包括用DRAQ5作為有核細胞設門，CD36/CD203/CD138/CD45/CD16/CD56組合。能夠識別11種細胞亞群，包括幼紅細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、幼稚粒細胞、原始細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞、NK細胞、漿細胞和血小板，此方案主要用于異常白細胞的分類。其他有用的組合包括，單管免疫表型用于淋巴增殖性疾病、骨髓發育異常、骨髓瘤或髓細胞增生性疾病的鑒別診斷。

      總之，從形態學出發，儀器能提供快速的、明確的、病理狀態答案，如白血病細胞大量增生、細胞數量明顯減少。而免疫方法作為新生事物，是一種新的白細胞分類法，必將對疾病的診斷、預后、隨訪提供更多幫助。目前免疫法仍有爭議，是使用通用管對白細胞進行分類，還是使用特定管對特定疾病提供附加信息。但是，很少有人懷疑，隨著血液分析儀的進步，儀器將提供更精確的報警，而ILD雖是一種比較昂貴的方法，但良好的設門策略，自動報警解決將是白細胞分類的未來。