熒光分光光度計基本原理

一、熒光的產生

構成物質的分子中存在電子，一般情況下電子總處在能量最低的能級(基態)，分子中同一軌道中的兩個電子白旋方向相反，凈電子自旋為0，以S=0表示，此時稱分子處于單重態，基態單重態以S1表示；分子吸收能量后受激的電子躍遷進入較高能級，若在躍遷過程中電子的自旋方向不改變，此時認為分子處于激發的單重態，可表示為第一激發單重態(S1)、第二激發單重態(S2)……；若在躍遷過程中伴隨著電子的自旋方向發生改變，此時分子中出現兩個自旋狀態相同的電子，以S=1表示，認為分子處于激發的三重態，以符號T表示，第一、第二激發三重態分別以T1、T2……表示。

基態電子吸收能量躍遷到較高能級的過程稱之為激發，處于激發態的電子不穩定，總具有躍遷回到基態、伴隨釋放能量的趨勢。躍遷方式主要有輻射躍遷和非輻射躍遷等。當以輻射方式躍遷時，能量轉化為相應的波長的光，這個過程即為發射，躍遷到激發態的電子大多處于單重激發態。如果電子直接從第一激發單重態的最低能級以輻射方式躍遷回到基態，這種發射光稱之為熒光，其壽命較短；若激發態電子弛豫到三重態，再以輻射方式躍迂回到基態，這種發射光稱之為磷光，其壽命相對較長。

二、激發光譜與發射光譜

熒光是一種光致發光現象。只有選擇合適波長的激發光，才可能得到合適的熒光光譜。若固定測量波長為熒光的最大發射波長，改變激發波長并記錄相應的熒光強度，根據所測得的熒光強度與激發光波長的關系即可繪制出激發光譜曲線。在激發光譜圖上的熒光強度最大處所對應的激發波長即為最大激發波長A。。。在最大激發波長的光照射下，處于激發態的分子數目最多，物質吸收的光能量也最多，自然能產生最強的熒光現象。

若固定熒光最大激發波長，不斷改變熒光的發射波長并記錄相應的熒光強度，根據發射波長與熒光強度關系可繪制出熒光發射光譜曲線，發射光譜即為通常所說的熒光光譜。發射光譜圖上的熒光強度最大處所對應的發射波長即為最大發射波長λem。

理論上，同種化合物的激發光譜與紫外-可見分光光度計上得到的吸收光譜的形狀應相同，實際上，由于熒光儀的光源、單色器、檢測器的光譜特性，表觀激發光譜與吸收光譜的形狀往往存在較大差異；校正后的激發光譜的形狀才與吸收光譜比較接近。

在實際測定中，激發光譜的波長掃描一般在190～650nm范圍內，發射光譜的波長掃描在200～800nm范圍內。化合物溶液的熒光光譜總是滯后于激發光譜，即存在斯托克斯位移。這是由于在熒光產生的過程中，存在各種形式的無輻射躍遷過程、能量損失。這也導致最大發射波長都較最大激發波長位置發生紅移，即λem>λex，同時發射光的強度也會比激發光的強度減弱很多。

化合物溶液的發射光譜與吸收光譜之間存在著“鏡像對稱”的關系。應用“鏡像對稱”規則，可以幫助判別某個吸收帶是屬于第一吸收帶中的另一振動帶，還是更高電子態的吸收帶。還可以用來判斷體系中是否有雜散光或者雜質的存在。

許多熒光物質具有特征的最大激發波長和最大熒光波長，可根據其發射光譜和激發光譜來鑒別這些熒光物質，同時在定量分析中可作為最靈敏的測定條件。

熒光量子產率(Φ)：是指物質發射熒光的光子數與吸收激發光的光子數的比值。

發射熒光的分子數
Φ=————————————
吸收激發光的光子數

Φ值在0～l，其大小取決于物質的分子結構、狀態及環境，如溫度、pH值及溶劑等。測定熒光量子產率時，多采用參比法，將待測樣品和已知熒光量子產率的參比熒光物質的稀溶液在同樣激發條件下測熒光發射譜，并對發射光譜峰的面積積分，同時，測量該激發波長的吸光度，然后，按照以下公式計算待測樣品的熒光量子產率。

Φu=ΦsFuAs / FsAu

式中Φu、Φs。——待測物質與參比物的熒光量子產率；

Fu、Fs——待測物質與參比物的積分熒光強度；

Au、As。——待測物質與參比物的吸光度。

熒光壽命(τ)：是激發光停止照射后，熒光強度衰減至原強度的e-1所需要的時間。它用來表征熒光物質S1激發態的平均壽命。熒光強度的衰變，通常遵從以下方程：

lnIo-lnIt=t/τ

式中Io—t=0時的熒光強度；

It—t=t時的熒光強度。

通過實驗測出不同時刻所對應的It值，然后以lnIt對時間t作曲線，由所得直線的斜率即可算出熒光壽命(τ)值。

三、定性原理

從熒光光譜圖可以獲得一些特征參數，如熒光波長、強度、偏振、壽命及量子產率等信息，既可以用作組分的定性檢測和定量測定，也可以用于一些物質的物理化學性質表征。

熒光物質的激發光譜和發射光譜特性(如譜圖形狀、最大峰位置等)、熒光強度及熒光量子產率等參數與物質的結構密切相關，將樣品的這些信息與某標準物質進行比對即可進行物質的定性鑒定。

能產生熒光的物質，其分子結構中必須具有吸光的特征官能團。在芳香化合物及其與金屬離子形成的配合物分子中，存在大的共軛π鍵或剛性的平面結構，可有效地吸收紫外光而產生熒光，因而常作為典型的熒光體。此外，熒光體的分子結構中芳雜環的數目越多，熒光峰越向長波長方向位移，熒光強度增加。在共軛環數相同下，具有線性環狀結構的化合物比非線性環狀結構的化合物的熒光波長要長一些。

具有平面剛性結構的熒光體分子通常具有較高的熒光效率，有利于增強分子剛性結構的因素都會增加物質的熒光強度。比較酚酞和熒光素可知，在熒光素中氧橋將三個芳環固定在一個平面，分子的共平面性增強，π電子的共軛度增加。在紫外光的照射下，熒光素可產生更強的熒光現象，酚酞的熒光則很弱。

取代基的性質也會影響熒光體的熒光特性和強度。芳烴、雜化化合物上的取代基改變常會引起激發光譜、發射光譜、熒光效率發生較大改變。一般說來，給電子取代基如NH2、一NHR、一NR2、一NHR2、一OH和一CN等都會使化合物的激發光譜、發射光譜的波長向長波方向移動，熒光效率提高；引入吸電子基團如一CO、一COOH、一CHO和一NO2等將使化合物的熒光強度減弱；引入鄰位和對位取代基增強物質的熒光，引入間位取代基則會抑制熒光。

此外，一些環境因素如溶劑性質、介質的酸堿性、溶液溫度等因素也會對熒光強度、熒光光譜的形成產生影響，不多贅述。

四、定量原理

對于某種熒光物質的稀溶液，溶液的熒光強度F和溶液吸收光能的程度以及物質的熒光效率有關：

F∝(Io一It)→F=K'(Io一It)

It一Io×10^-εbc

式中K'——常數，取決于熒光物質的量子產率Φ；

I0——入射光強度；

It——透過溶液后的光強度。

根據朗伯-比耳定律：

F=K'(Io一Io×10-εbc)=K'Io(1一e-2．303εbc).

式中ε——熒光體的摩爾吸光系數；

b——樣品池厚度；

c——熒光體的濃度。

當2．303εbc≤0．05時(濃度很小，溶液較稀時)，

F=K'Io×2．303εbc

對于熒光物質的稀溶液，當Io及b一定時，

F=Kc

即在低濃度(2．303εbc≤0．05)時，溶液的熒光強度與熒光物質的濃度呈(線性)正比關系。此即為熒光定量分析的基礎。熒光強度正比于濃度僅限于溶液濃度極稀的情況，在較濃溶液中，該關系將不復存在。

與吸光度法相比，熒光分析法具有更高的靈敏度。對于低濃度樣品，熒光分析法具有很大優勢，準確度比吸光度法高100倍。原因在于熒光分析法是以熒光自身作為信號，很小的熒光也能被檢測到，而且，熒光波長不同于激發波長，它不會受到激發光的影響。