使用熒光標記物的研究者最多，因而相應的探測方法也就最多、最成熟。由于熒光顯微鏡可以選擇性地激發和探測樣品中的混合熒光標記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時，分辨能力在實際應用中可接近由數值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎。
大多數方法都是在入射照明式熒光顯微鏡（epifluoescence microscope）基礎上發展起來的，包括激光掃描熒光顯微鏡、激光共焦掃描顯微鏡、使用了CCD相機的改進的熒光顯微鏡以及將DNA芯片直接制作在光纖維束切面上并結合熒光顯微鏡的光纖傳感器微陣列。這些方法基本上都是將待雜交對象 以熒光物質標記，如熒光素或麗絲膠（lissamine）等，雜交后經過SSC和SDS的混合溶液或SSPE等緩沖液清洗。