最近做酶切連接轉化，最后做鑒定時，以菌落為模板進行PCR時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到LB液擴菌后，以菌液為模板進行PCR時卻什么東東都沒有?請問會是什么原因啊?多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行PCR檢測，再重新以菌液為模板進行PCR檢測，因為菌落或者菌液PCR假陽性的幾率還是比較高的。但如果還是出現以上結果，推測很可能是平板上殘留的連接液中的未連接上載體的目的條帶引起的，此時建議再提質粒做PCR檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連接成功。 個人的見解希望對你有所幫助，也期望高手們批評指正!我覺得菌落PCR效果很好，雖然有假陽性的可能，但是只要是做出來，有目的條帶一般是對的，你為什么還要用菌液做PCR?你還不如搖菌后提取質粒然后用質粒PCR或者酶切。既然你說到這個問題了，我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了，因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌，所以就沒有質粒，怎么能做出來。我覺得你做菌液的PCR和菌液的PCR必須是從單一的一個菌落挑出來的，如果不是，那肯定只有一個是正確的，我做過，只要是同一菌落不會有差錯。你再試試看，祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落后搖菌，然后提取質粒，然后以質粒為模板做PCR，陽性的質粒再酶切進行鑒定，效果還可以。再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點，不確定對不對，借道跟大家討論一下，不知道lcc有沒有文獻支持一下這種觀點?如果這種觀點正確，那我以前很多關于T載體的看法就錯了，所以很感興趣。我一直以為外面的DNA片段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連接液中的未連接上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪，以前我就是挑菌后加到LB液后搖菌，然后以菌液為模板進行PCR，再以陽性管提取質粒進行酶切鑒定，排除陰性管，這樣可以少提一些質粒。最近菌液PCR總是陰性，所以就直接提質粒進行鑒定了。其中原因真的不知道是什么?我也遇到過，也許是涂抹的轉化產物導致的加陽性(菌落PCR)。各位大大，我倒是碰到過菌液PCR是陰性，但是有質粒的情況，酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑒定是最保險的。PCR假陽性。假陰性的概率都很高。菌液的問題在于鹽!鹽會干擾PCR。 如果用菌液的話，可以用水洗滌離心幾次，然后重懸于水，就可以了。 題外話:最近菌落PCR，陰性和陽性對照經常不擴增，而樣品擴增，郁悶啊。