(1)蛋白質樣品的制備 :有兩種方法(直接加樣緩沖液來裂解細胞,制備細胞蛋白質提取液)。
(2)十二烷基酸鈉-聚丙烯電泳(SDS-PAGE分離原理:根據蛋白質的分子差異)
電泳:在直流電場作用下,帶電的粒子向著與自身電荷相反的方向移動的現象。電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。
(3)蛋白質的電轉移 采用的固相支持物有很多種,常用的有硝酸纖維素膜和聚偏氟乙烯。
可以根據需要轉移蛋白質的分子量大小,選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為可以隨著膜孔徑的不斷減小,這樣膜對低分子量蛋白質的結合就更加牢固。
蛋白質是帶負電荷的,所以應該置于凝膠的負極側,硝酸纖維素膜置于正極一側,這樣接通電源后,凝膠中的蛋白質就可以由負極向正極轉移到硝酸纖維素膜上,完成蛋白質的轉移工作。 重要影響因素:轉膜緩沖液的組成對于蛋白質與膜和探針的結合起著非常重要的作用。
(4)靶蛋白的免疫學檢測:
1.封閉:在硝酸纖維素膜和蛋白質結合之外,還可以為檢測試劑的特異性的第抗體發生非特異性結合。這樣使Western印跡的背景提高,所以需要對硝酸纖維素膜上面的潛在結合位點進行封閉操作。
封閉劑:凝集素,血白蛋白,牛血清白蛋白,酪蛋白,脫脂奶粉等根據要求合理的選擇用哪一種。
2.靶蛋白與第抗體反應:抗體是蛋白質印跡技術中最常用的標記探針同時也是免疫印跡實驗成敗的關鍵因素之一。
3.靶蛋白與第二抗體反應:這里的第二抗體是針對第一抗體的免疫球蛋白,是可以用放射性核素或者非放射性物質標記。
目前常用的二抗:堿性磷酸酶,辣根過氧化物酶。
4.顯色:AKP(堿性磷酸酶)可以和催化底物BCIP(四硝基藍)與氮藍四銼(NBT)發生反應,產生深藍色,就是蛋白質所在的位置。
另一種是檢測辣根過氧化物酶:辣根過氧化物酶在過氧化氫的存在下,可以氧化魯米諾使其法光,并使其的光強度增加1000倍,在經過X線膠片可以顯示蛋白質所在的位置和含量。