蛋白質純化武器——工藝篇（二）

（2）包涵體溶解
    看了包涵體洗滌部分，怎么溶解包涵體應該心中有數了。無非就是pH，變性劑，還原劑，表面活性劑等等的組合。經典的包涵體溶解液的配方為：pH8.0，20mM Tris，8M Urea。說它經典，是因為我用的最多，嘻嘻。再根據個性蛋白純化的需要往這個配方里面加調料，如Ni柱純化的咪唑、氯化鈉；溶解或吸附不好時再加點DTT、Triton。
 
    包涵體的溶解也有兩個小Trick，獨門秘籍哦。第一，包涵體沉淀在溶解時往往會有一些像硬膠狀的塊塊，有彈性，很難溶。你可以在加變性劑之前，加一點buffer進去，用玻璃棒或硬塑料棒攪成面糊糊，盡量不要有大塊塊。然后再加變性劑磁力攪拌溶解，要溶解迅速得多哦。第二，可以借助超聲來溶解。像超聲破菌一樣操作，超聲次數30-50次。超聲不僅僅是有利于包涵體溶解，還有一個功效就是打斷核酸，降低粘度。這對離心和過濾很重要，很重要。我們在溶解包涵體后往往離心傾倒上清時，溶液很粘，一不小心底部的沉淀就跟出來了；還有過濾時濾不動。這都是沒有超聲的原因。
六、純化方法
    領袖說過：不管黑貓白貓，抓到老鼠就是好貓。對純化來講，能拿到純度好的蛋白，符合你純化的要求就是硬道理。純化方法不好講，各種蛋白不一樣，純化工藝自然不同；即使相同的原料也有不同的純化方案。純化的方法我們有層析、沉淀、萃取、透析、超濾等等。
 
    柱層析是純化最強有力的手段，幾乎每種蛋白的純化都會用到層析。各種層析方法：如親和、離子交換、疏水、反相、分子篩等等都是我們工藝寶庫里的吃飯家伙。不知道怎么吃啊，沒辦法了，你還是先去補一補基礎知識吧。GE公司的一套書個人認為是最佳的入門資料，如Recombinant Protein Purification，Affinity Chromatography，Ion-Exchange chromatography，Gel Filtration，等等，在GE的網站上應該能下載到，或者干脆打個電話給GE的銷售員或技術支持，請他給你一個光盤就什么都有了。
 
    在做純化之前，我們需要知道一些待純化蛋白的信息。如蛋白質序列，載體類型，理論等電點，理論分子量，疏水性等等，這些都是computer paper work，電腦上查查就有了。如果還能查到一些與目標蛋白純化相關的文獻也不錯，不過沒有也沒關系。我是較少查文獻的，奉行的原則是：與其看不如自己做，看了也難以做出來，做不出來了再去看。我就是一個工匠，操作工，而不是做科學的哦。這也是我對純化的看法，好聽一點的就是實踐的科學，哈哈。
 
    查文獻的目的不在于copy它的純化工藝，這是新手最最常犯的毛病，以為copy文獻就能完成純化工藝了。要知道文獻的真實性是有一點折扣的，作者的原料和純化的目的與你也不相同。查文獻的主要目的在于了解你要純化的蛋白的性質，它的一些檢測方法，特別是有關于活性的檢測方法。
 
    怎么講這一節呢？各種純化的原理我就不講了，也不可能有瑞典老兄書上講得好（GE層析的根在瑞典的uppsala），還是舉例來說明吧，做一些簡單的分析。講兩個實例，一個是可溶表達的蛋白，一個是不可溶表達的蛋白。
（一）、可溶表達的蛋白A
1、computer paper work：
    大腸桿菌BL21，pET32a載體融合表達，N端融合Trx（硫氧還蛋白109aa）和his6-tag（共49aa），DDDDK腸激酶位點后為需要的目標蛋白A，融合蛋白的分子量為21.2kd，Trx（DDDDK前）的分子量為17.1kd，蛋白A的分子量為4.1kd，蛋白A穩定性好，水溶性好，融合蛋白的理論等電點為5.9，Trx（DDDDK前158aa）的理論等電點為5.4，蛋白A的理論等電點為9.7。
2、純化要求
    符合重組藥用蛋白要求，SDS-PAGE純度大于95%，HPLC純度大于95%，Western Blott單一條帶，去除內毒素。
3、純化設計分析
此為一典型的小分子蛋白融合表達實例。
由于有his6-tag融合可溶表達，可以采用Ni柱來進行初步純化。
融合蛋白的理論等電點為5.9，可以考慮用Q柱、DEAE柱來吸附純化。
融合蛋白需要酶切去除融合片斷，要做腸激酶酶切工藝。
蛋白A的理論等電點為9.7，可以考慮用SP柱來吸附純化。
酶切后的蛋白純化可利用his-tag和pI的差異。
目標蛋白的分子量較小，有可能試一試反相純化。
純化樣品要求去除內毒素，可以用Q柱、DEAE柱來吸附內毒素。
4、純化流程
（1）破菌離心：
采用pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl緩沖液超聲破菌，離心上清過濾后，量體積，加咪唑至55mM，調節pH為8.0。
點評：破菌緩沖液先不加咪唑，是為了更精確的保證咪唑的濃度，因為破菌過程中，菌體內液體的釋放會稀釋咪唑濃度。
 
同理，上柱前的樣品要調節pH，因為破菌會使樣品的pH下降，細心的話，檢測一下，可見pH會從8.0下降到7.7-7.8左右。
55mM咪唑濃度是經過了分段洗脫優化的結果，最大程度地保證目標蛋白吸附，而雜蛋白穿透。做優化時，起始的咪唑濃度一般選擇10-20mM咪唑，5-10mM分段加上去。
（2）Chelating Sepharose FF柱純化：
pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl，55mM咪唑緩沖液平衡后上樣；相同緩沖液淋洗完全至基線；150mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脫融合蛋白；250mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脫雜蛋白。
 
點評：Chelating Sepharose FF填料是Ni-IDA類型的介質，最大的好處就是可以反復再生使用，特別是脫鎳后用NaOH洗柱可以有效地去除內毒素，徹底將填料清洗干凈。
 
150mM咪唑洗脫融合蛋白也是前期分段洗脫優化的結果，綜合考慮了純度和收率以及收樣體積的因素。更低的咪唑濃度，如100-120mM咪唑也可將融合蛋白洗脫下來，但是洗脫峰很拖尾，純度雖然好一些，可收樣體積要大許多，收率也略低。
 
250mM咪唑洗脫雜蛋白不是此工藝中的要點。實際上，我們在操作過程中往往沒有此步驟，就直接用EDTA將柱脫鎳再生了。
鎳柱在上樣后的緩沖液淋洗階段，峰往往很拖尾，要耐得住性子，讓它淋洗完全。
此柱的融合蛋白載量大約為20mg/ml。不同的鎳柱，不同的蛋白，載量也是不同的。
經過一步Chelating Sepharose FF純化，融合蛋白的SDS-PAGE純度大約為90%。
（3）Sephadex G-25（fine）換液
pH8.0，20mM PB做緩沖液置換。更換Chelating柱洗脫融合蛋白的溶液體系，使得適合腸激酶酶切的要求。
 
點評：Sephadex G-25（fine）的上樣量大約為柱體積的30-35%，有輕微的純化作用，有時候可以去除一些電泳上看不到的小分子雜質。
 
在酶切之前，本例也做過Q柱吸附純化融合蛋白試驗，吸附沒問題，也能做到進一步的純化。只是后來在工藝整合過程中發現此步不是必需的，就省略掉了。
（4）腸激酶酶切
酵母表達的重組牛腸激酶，酶切用量每16mg融合蛋白用腸激酶1個單位，酶切體系為pH8.0，20mM PB，酶切溫度35-37℃，酶切時間16小時。
 
點評：商品化的腸激酶有多種，有生化提取的，有重組大腸桿菌的，還有就是重組酵母表達的，其中以重組酵母表達的腸激酶活性最高。
 
此處的腸激酶活性單位為Invitrogen公司產品標準，定義可以參考Invitrogen公司的EKMax manual，不過Invitrogen公司的推薦參考量太低了，它的標準是1個單位20ug融合蛋白，哈哈。
 
Invitrogen公司的標準酶切體系是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, and 0.1% Tween-20。本例中沒有加CaCl2和Tween-20，試驗表明無明顯影響。如果你的融合蛋白不好切，可以考慮增加這兩項。
 
此處的酶切用量標準由酶切梯度試驗獲得。即固定融合蛋白量，加入不同單位的腸激酶，SDS-PAGE比較酶切效果。取融合蛋白酶切約80-90%的量。可能有人會問，為什么不是95-100%？做過酶切梯度的就會知道，這個10%量的增加是以酶量成幾倍增加才能實現，而且酶量越大，非特異性切割的可能性就越大。
 
酶切時間取16小時是因為下班前加好酶，第二天上班時正好是16個小時，符合我等工作節奏哦。
酶切可置于恒溫搖床上進行，轉速開得緩慢點。小量酶切就放在恒溫培養箱中。
（5）Q Sepharose FF柱純化
pH8.0，20mM PB平衡Q柱，上樣酶切后樣品，目標蛋白穿透，未酶切的融合蛋白和Trx-histag吸附于柱上。
點評：此步純化很簡單，僅僅是個流穿純化，但效果非常好。Q柱不僅去除了絕大部分的雜蛋白，而且還去除了內毒素和酶切時加入的腸激酶。
Q柱在平衡前要用0.5N的NaOH洗柱以去除內毒素，平衡緩沖液要用注射用水配制且通過3kd的超濾膜來去除緩沖液中的內毒素。
樣品在上Q柱前，要進行過濾操作。酶切過程中會有少量的沉淀產生，可能是因為我沒有往酶切體系中加0.1% Tween-20。藥用蛋白不敢隨便加表面活性劑，否則要在QC中驗證工藝可以完全去除。酶切加入的腸激酶就必須做去除的QC驗證，這是后話了。
Q/DEAE類型的陰離子交換柱是純化中應用最廣泛的操作。因為大部分蛋白質的等電點在中性或偏酸性，陰離子交換柱可以吸附純化。換而言之，如果你的目標蛋白等電點比較高，那么恭喜你了，純化要方便多了。還不明白？你的目標蛋白與眾不同啊，就像本例中的蛋白A，用Q柱可以高效的穿透純化。
酶切后經過Q柱純化，蛋白A的SDS-PAGE純度可以達到95%以上，基本上看不到明顯的雜帶。但做反相HPLC檢測，純度只有85%左右。由于兩種檢測方法的原理不同，樣品中可能含有一些小分子的雜質，電泳檢測不到，而反相HPLC可以檢出。還有一個可能，就是酶切畢竟是個蛋白酶的水解過程，特異性再好也有錯切的時候。也許有少量的蛋白A被多降解了幾個氨基酸。另外就是目標蛋白質本身可能有高級結構方面的差異。回想起來，那可是一段沮喪的日子。***尚未成功，同志仍需努力。
（6）SP Sepharose FF柱純化
pH5.8，20mM PB平衡SP柱，Q柱穿透樣小心調節pH5.8后上樣SP柱，目標蛋白吸附于柱上。 pH5.8，20mM PB，90mM NaCl洗脫雜蛋白峰。然后從90mM—300mM NaCl做線性梯度洗脫。分段收集洗脫峰，HPLC檢測。
點評：此步SP柱純化是關鍵性步驟，使得目標蛋白從SDS-PAGE純度95%上升到HPLC純度大于95%。
 
一般對離子交換層析來說，與等電點相差2個pH單位就可以有效吸附。此步的緩沖體系pH為5.8，這個差值達到了4，比較特殊。確定此pH值經過了多次的小試研究，高點的pH蛋白A都難以吸附完全，也不利于梯度洗脫分離，這點當時很難理解。后來在研究蛋白A的理論滴定曲線時，終于找到了理論依據。原來蛋白A的理論等電點雖然為9.7，但在滴定曲線上，從9.7到6.5的很長一段曲線都是平緩的。也就是說從pH9.7到pH6.5，蛋白A所帶的凈正電荷都很少，只有0—1個單位左右。當pH為5.8時，蛋白A的凈正電荷達到3個單位，這時才能有效吸附。通過本例也可以發現，決定蛋白吸附的不是等電點的差異多少，而是所帶凈電荷的多少。可能一個蛋白質x比蛋白質y的pI高，但在某個pH時，蛋白y可以吸附陽離子柱，而蛋白x卻吸附不好。所以，在理論上，做純化要善用滴定曲線的差異，特別是小分子的蛋白質，它們普遍有著凈電荷與pH不敏感的現象。
 
90mM NaCl洗脫雜蛋白峰和后面的線性梯度洗脫都是多次小試試驗優化的結果。細心點的戰友可能會發現，此步中，樣品在上柱前調節完pH后并沒有經過換液或透析操作，就直接上樣了。樣品的pH從8.0調節到5.8，體系的電導值會增加很多。大約會從2ms/cn上升到8ms/cn左右。通常這種樣品是不能直接上樣離子交換柱的。但本例的蛋白A在pH5.8時吸附SP柱很好，90mM NaCl不會洗脫下，所以可以直接上樣。在做工藝優化時，也是有意識的想省略掉換液操作這一步，而將體系的pH適當降低了，實際在做實驗時，pH6.2條件蛋白A也可以吸附SP柱，但樣品的電導值必須降低，也就是要做換液操作或大量稀釋。
 
線性梯度洗脫，分段收集洗脫峰是本工藝中的一個弱點。蛋白A的總純化收率主要損失在這一步。做過不少試驗，想把梯度洗脫改成分段洗脫方式，均未獲得成功。可能是雜質與目標蛋白的差異很小吧，分段洗脫對收率的影響更大。好在本例的蛋白表達量很高，而且作為藥用蛋白的使用量很低，所以純化收率的多少對生產的總成本影響不大，它的生產成本主要在凍干和包裝上。
至此，蛋白A的純化工藝全部完成。