實驗儀器:電泳儀 電泳槽 血清加樣帶 分光光度計 濾紙 剪刀
實驗材料:醋酸纖維素膜 規格2×8cm。
實驗試劑:
l. 巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(PH8.6+ 0.1. 離子強度0.06):稱取巴比妥2.21g,巴比妥鈉12.369于500ml蒸餾水中,加熱溶解,待冷至室溫后,再用蒸餾水補充至于1L。
2. 氨基黑 10B染色液:稱取氨基10B 0.1g,溶于無水乙醇20ml中,使溶解。另取磺基水楊酸2.5g,溶于74.5ml蒸餾水中,再將二液混合搖勻。
3. 漂洗液:甲醇45ml,冰醋酸5ml和蒸餾水50ml,搖勻.
4. 0.4 M 氫氧化鈉溶液。
實驗操作:
1. 將緩沖液加入電泳槽內,調節兩側槽內的緩沖液,使其在同一水平面上。
2. 醋纖膜的準備:取在緩沖液中浸泡的醋纖膜一張,在毛面的一端(負極側)1.5厘米處,用鉛筆畫一橫線,作點樣標記,編號后,將醋纖膜置于巴比妥-巴比妥鈉緩沖液中浸泡,待充分浸透后取出(一般為二十分鐘)夾于潔凈濾紙中間,吸去多余的緩沖液。
3. 將醋纖膜毛面向上貼于電泳槽的支架上拉直,用微量吸管吸取無溶血血清在橫線處沿橫線加3-5微升。樣品應與膜的邊緣保持一定距離,以免電泳圖譜中蛋白區帶變形,待血清滲入膜后,反轉醋纖膜,使光面上平直地貼于電泳槽的支架上,用雙層濾紙或四層紗布將膜的兩端與緩沖液連通,稍待片刻.
4. 接通電源,注意醋纖膜上的正負極,切勿接錯.電壓90-150伏,電流0.4-0.6mA/cm寬(不同電泳儀所需電壓. 電流可能不同,應靈活掌握);夏季通電45分鐘,冬季通電60分鐘,待電泳區帶展開約25-35mm。,即可關閉電源。
5. 染色:通電完畢,取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中,染色5-10分鐘(以白蛋白染透為止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景無色為止。
6. 定量:將漂洗凈的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白區帶放入相應的試管內,在白蛋白管內加 0.4M氫氧化鈉溶液6ml(計算時吸光度乘2),其余各加3ml,振搖數次,置37度水箱20分鐘,使其染料浸出. 對于浸出的氨基黑10B,用分光光度計,在波長600-620nm讀取各管吸光度,然后計算各自的含量(在醋纖膜的無蛋白區帶部分,剪一條與白蛋白區帶同寬度的膜條,作為空白對照).
計算:
各組分蛋白%=Ax/At×100%
各組分蛋白g/L=各組分蛋白百分數×血清總蛋白g/L
AX表各組分蛋白吸光度At表各組分蛋白吸光度總和
參考值:

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