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  • 發布時間:2019-04-13 12:15 原文鏈接: 血清蛋白醋酸纖維素膜電泳檢測試驗

    實驗方法原理帶電質在電場中向與其極性相反的方向流動的現象稱為電泳.血清中各蛋白質都有不同的等電點,當將其置于比其等電點高的PH緩沖液中時,他們都將帶負電荷在電場中向正極泳動.由于各蛋白質等電點及所帶電荷量和分子量大小都有所不同,因而在電場中泳動速度不同,利用這個特點將血清中各種蛋白質分開.
    實驗材料

    醋酸纖維素膜

    儀器、耗材

    電泳儀電泳槽血清加樣帶分光光度計濾紙剪刀

    實驗步驟

    實驗儀器:電泳儀 電泳槽 血清加樣帶 分光光度計 濾紙 剪刀

    實驗材料:醋酸纖維素膜 規格2×8cm。

    實驗試劑:

    l. 巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(PH8.6+ 0.1. 離子強度0.06):稱取巴比妥2.21g,巴比妥鈉12.369于500ml蒸餾水中,加熱溶解,待冷至室溫后,再用蒸餾水補充至于1L。

    2. 氨基黑 10B染色液:稱取氨基10B 0.1g,溶于無水乙醇20ml中,使溶解。另取磺基水楊酸2.5g,溶于74.5ml蒸餾水中,再將二液混合搖勻。

    3. 漂洗液:甲醇45ml,冰醋酸5ml和蒸餾水50ml,搖勻.

    4. 0.4 M 氫氧化鈉溶液。

    實驗操作:

    1. 將緩沖液加入電泳槽內,調節兩側槽內的緩沖液,使其在同一水平面上。

    2. 醋纖膜的準備:取在緩沖液中浸泡的醋纖膜一張,在毛面的一端(負極側)1.5厘米處,用鉛筆畫一橫線,作點樣標記,編號后,將醋纖膜置于巴比妥-巴比妥鈉緩沖液中浸泡,待充分浸透后取出(一般為二十分鐘)夾于潔凈濾紙中間,吸去多余的緩沖液。

    3. 將醋纖膜毛面向上貼于電泳槽的支架上拉直,用微量吸管吸取無溶血血清在橫線處沿橫線加3-5微升。樣品應與膜的邊緣保持一定距離,以免電泳圖譜中蛋白區帶變形,待血清滲入膜后,反轉醋纖膜,使光面上平直地貼于電泳槽的支架上,用雙層濾紙或四層紗布將膜的兩端與緩沖液連通,稍待片刻.

    4. 接通電源,注意醋纖膜上的正負極,切勿接錯.電壓90-150伏,電流0.4-0.6mA/cm寬(不同電泳儀所需電壓. 電流可能不同,應靈活掌握);夏季通電45分鐘,冬季通電60分鐘,待電泳區帶展開約25-35mm。,即可關閉電源。

    5. 染色:通電完畢,取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中,染色5-10分鐘(以白蛋白染透為止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景無色為止。

    6. 定量:將漂洗凈的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白區帶放入相應的試管內,在白蛋白管內加 0.4M氫氧化鈉溶液6ml(計算時吸光度乘2),其余各加3ml,振搖數次,置37度水箱20分鐘,使其染料浸出. 對于浸出的氨基黑10B,用分光光度計,在波長600-620nm讀取各管吸光度,然后計算各自的含量(在醋纖膜的無蛋白區帶部分,剪一條與白蛋白區帶同寬度的膜條,作為空白對照).

    計算:

    各組分蛋白%=Ax/At×100%

    各組分蛋白g/L=各組分蛋白百分數×血清總蛋白g/L

    AX表各組分蛋白吸光度At表各組分蛋白吸光度總和

    參考值:



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    注意事項

    失敗原因:

    1. 電泳圖譜不整齊:點樣不均,薄膜未完全浸透或溫度過高致使膜面局部干燥或水分蒸發,緩沖液變質:電泳時薄膜放置不正確,使電流方向不平行.

    2. 蛋白組分分離不佳:點樣過多,電流過低,薄膜結構過分細密,透水性差,導電性差等.

    3. 染色后白蛋白中間著色淺:由于染色時間不足或染色液陳舊所致:若因蛋白含量高引起,可減少血清用量或延長染色時間,一般以延長2分鐘為宜.若時間過長,球蛋白百分比上升,A/G值會下降.

    4. 薄膜透明不完全:溫度未達到90度以上將標本放入烘箱,透明液陳舊和浸泡時間不足等。

    5. 透明液上有氣泡:玻璃片上有油脂,使薄膜部分脫開或貼膜時滾動不佳.

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