通過新一代測序來分析拷貝數變異

　　對于精準醫療而言，理想的情況是測定每位患者的遺傳變異，并根據結果及其他因素開出適當的藥物。具體到癌癥，遺傳變異包括單核苷酸替換和插入/缺失、基因拷貝數變異、部分或整個基因缺失、大的染色體區域的重復或缺失，以及染色體易位和其他重排。

　　HER2基因是癌癥精準醫療的首批治療靶點之一，并且已經改變了HER2陽性乳腺癌的治療。自從發現HER2基因擴增并將其作為治療靶點以來，測定拷貝數變異的技術在不斷發展。利用最新的高通量拷貝數檢測方法，人們可以更好地鑒定這些重要的基因變異，并深入了解它們與疾病的關系。

克服挑戰

　　在檢測全基因組的拷貝數變異（CNV）時，過去常用的方法是比較基因組雜交（CGH）和基因分型芯片。CGH利用長寡核苷酸探針來比較差異標記的靶點和參考DNA之間的熒光信號。基因分型芯片則不同，它利用短序列來捕獲DNA片段，并根據不同的雜交強度來推導拷貝數。

　　雖然基于芯片的方法能夠帶來高效、靈敏且大規模的拷貝數分析，但它們也存在一些挑戰，包括雜交噪音、分辨率低、基因組覆蓋范圍有限，以及難以檢測新型或局灶性CNV。

　　隨著新一代測序（NGS）平臺的快速興起，研究人員近來已經開發出基于NGS的方法來全面鑒定CNV。與芯片方法相比，NGS能夠帶來更高的覆蓋度和分辨率、更準確的拷貝數評估，同時還能夠檢測其他類型的變異，包括小的變異和染色體易位。

　　從理論上講，將NGS方法應用于CNV檢測是非常簡單的。“拷貝數改變的檢測其實是一個read計數的應用。如果A基因經歷了擴增，那么相對于基因組中的其他基因存在更多的拷貝。因此，在對擴增子進行測序時，A基因的測序read將會成比例地增加，”Thermo Fisher Scientific腫瘤學研發總監Seth Sadis解釋道。

　　不過，主要的挑戰在于重復性和可靠性，同時必須考慮變化和噪音。“既然這是一個計數應用，那么各種外部因素和內部因素都會引入變化，外部因素包括不同的PCR儀、不同批次的試劑、不同人員的處理，而內部因素則包括擴增子長度和GC含量，”Thermo Fisher Scientific的生物信息學家Jim Veitch解釋說。

　　為了對拷貝數變化進行準確可靠的檢測，必須對每個擴增子的read計數進行均一化，以便排除外部和內部因素引入的差異。同時，那些腫瘤含量有限的樣本更具挑戰性。于是，Thermo Fisher的Ion Torrent技術通過機器學習方法來去除擴增偏倚，對不同樣本制備過程的read計數進行均一化。

新型工具

　　Sadis指出，Ion Torrent的拷貝數分析方案經過驗證，適用于起始量低的樣本，或者FFPE樣本、細胞學標本或細針穿刺樣本。此系統基于半導體測序平臺，帶來了快速的測序流程。同時，集成的軟件流程為變異解釋提供了解決方案，并自動將它們與公共數據庫相關聯。

　　日本山梨縣中央醫院的Yosuke Hirotsu最近就通過研究證實，Thermo Fisher Scientific新開發的Oncomine? BRCA1/2 Panel是一種快速準確的檢測系統，能夠同時檢測致病變異和拷貝數改變。

　　Hirotsu對BRCA1和BRCA2基因中的生殖系突變很感興趣，這些突變讓患者容易患上遺傳性乳腺癌和卵巢癌。致病性BRCA1/2變異的檢測對癌癥的預防和診斷至關重要。研究團隊在147名乳腺癌和/或卵巢癌患者中檢測到21種致病的生殖系變異，支持了這種產品在突變檢測上的相關性。

應用爆炸

　　如今的應用正從簡單的拷貝數檢測轉向其他類型的染色體改變，如染色體臂的擴增或缺失以及染色體碎裂，這些也與疾病息息相關。新工具可更精確地估計癌癥樣本中的腫瘤含量，從而對腫瘤內的拷貝數估計值進行均一化。

　　事實上，德國環境健康研究中心的Jan Smida及其同事最近利用Affymetrix CytoScan高密度芯片來評估160個骨肉瘤樣本中的體細胞拷貝數改變。研究團隊鑒定出常發生突變的基因或區域，并揭示出骨肉瘤特異的不穩定區域。他們的研究證實了疾病特異的基因組脆性區域，為深入研究骨肉瘤的復雜機理提供了新線索。

　　Veitch指出：“對癌癥而言，挑戰之一是檢測與腫瘤抑制基因失活相關的拷貝數丟失。如果腫瘤抑制基因失活，其中一種機制就是失去了一部分，但許多突變都是新發的。”腫瘤抑制基因的失活方式可以有很多種，包括整個基因丟失，部分基因丟失，或序列改變導致功能喪失。了解這些過程何時發生以及如何發生，將是一項有趣的工作。

　　一直以來，拷貝數變異都與基因表達變化和疾病發展相關聯。現在有了新型的芯片和NGS技術來獲取這些知識，研究人員能夠開展更深入的變異分析和篩選，并開拓一片更廣闊的應用天地。