重組的果蠅ACF的表達和純化實驗

高滴度的 Acf1－FLAG 和 ISWI 桿狀病毒儲液晚對數期的懸浮培養的 Sf9 細胞

公磷酸緩沖鹽溶液（PBS）裂解緩沖液 FFLAG-M2 樹脂 1：1（V V）懸浮液（Sigma－Aldrich）稀釋緩沖液 F洗滌緩沖液 F洗脫緩沖液 F液氮牛血清白蛋白 （BSA） 標準

錐形離心瓶Wheaton 杜恩斯勻漿器A 型研磨棒Sorvall Superspeed 離心機

1. 桿狀病毒儲液在感染前擴增幾天。

為擴增病毒，Sf9 細胞以 2×10⁷ 細胞/皿植于 150 培養皿上，加入適當的有血清的培養液至25 ml， 并且以感染重數（MOD 為 0.1～0.5（每盤細胞加入 10～20 ul 病毒懸液）進行感染。為了獲得病毒的儲液儲存，感染 60 h 并在無菌條件下收集培養液上清。對于高滴度的儲液（將進一步用于表達感染），感染可以進行到細胞發生裂解為止（His－NAP－1 病毒約 72 h， ISWI 和 Acf1－FLAG 約 84 h）。這一過程產生的病毒儲液的滴度接近或高于每毫升 10⁹ pfu。在無菌條件下吸出皿中的培養液，于 4℃ 避光保存在 50 ml 管中至少 12 個月，并且不會喪失明顯的滴度。

2. 以 0.5×10⁶ 細胞/ml 接種 SF9 細胞至 150～500 ml 旋轉式培養瓶中，并生長 2～3 天。將 SF9 細胞按照 2.5×10⁷～3×10⁷ 細胞/皿分到 5～25 個平皿中，每皿加入適當的昆蟲培養基至 25 ml。在組織培養箱中放置 20 min，使細胞沉降，用重組的 Acfl－FLAG 和 ISWI 桿狀病毒以 MOI 為 5～10 感染細胞。

3. 感染 44～46 h 后，吸出培養液并用 10 ml 冰冷的 PBS 每皿將細胞沖洗下來。在 250 ml 錐形瓶或 50 ml 管子中使用臨床離心機 4℃，2000 r/min 離心 5 min。

4. 在冷室或于冰上操作，用 8 ml 裂解緩沖液 F 重懸細胞，用 Wheaton 杜恩斯勻漿器 破碎細胞（使用 A 型研磨棒；于冰上， 在 30 min 內，10 次勻漿進行 3 遍）。

5. 4℃， 在 14 ml —次性錐形離心管中 14 500 g （SS－34 轉子 11 000 r/min） 離心 10 min 沉淀不溶物。在上清液中加入 250 FLAG－M2 樹脂（經裂解緩沖液 F 平衡的 1：1 的懸浮液）和 7 ml 稀釋緩沖液 F。混合液在 15 ml 帶蓋聚丙烯管中 4℃ 于搖床上混勻 3～4 h。

6. 洗滌樹脂 4 次，每次使用 12 ml 洗滌緩沖液 F，接著于 4℃，在臨床離心機上 2000 r/ min 離心 3 min，吸去上清并重懸。

7. 按如下步驟洗脫蛋白質：

7.1 在步驟 6 的樹脂沉淀中加入 100 洗脫緩沖液 F 重懸樹脂。

7.2 將樹脂轉移到 1.5 ml 硅烷化的微量離心管中。

7.3 冰浴 10 min。

7.4 以最大轉速離心 30 S。

7.5 將上清轉移到另一個管子中（與下一步的洗脫液混合）。

7.6 繼續在同一個硅烷化的微量離心管中再重復步驟 7.1、7.3、7.4、7.5 3 次，將所有的洗脫液混合到一起。

8. 將蛋白質分裝（每管 20～50），用液氮速凍并于 -80℃ 保存。

9. 可選：將蛋白質與一系列標準濃度的 BSA 同時進行 SDS-PAGE 電泳，并進行考馬斯亮藍 R－250 染色，以估計蛋白質的濃度。