鑒定分析植物蛋白復合物的藍綠非變性凝膠電泳實驗

試劑、試劑盒：

十二烷基 β-D-麥芽糖苷增溶液                                                                  

TritonX-100 增溶液                                                                  

洋地黃阜苷增溶液                                                                  

考馬斯亮藍染色液                                                                 

丙烯酰胺溶液                                                                  

BN 凝膠緩沖液

實驗步驟：

3.1 BN-PAGE 樣品的制備

所有樣品制備步驟必須在 4°C 下操作，在開始制備樣品前（見 26.3.1 節 1 和 26. 3.1 節 2) ，要制備好 BN 凝膠（見 26. 3. 2) 。

1. 膜組分

( 1 ) 按照標準的方法步驟制備要研究的膜組分，如細胞質膜、類囊體膜或線粒體膜。或者使用完整細胞器，如質體、線粒體或過氧化物酶體，作為 BN-PAGE 的初始實驗材料。

( 2 ) 確定蛋白質濃度，如用 Lowry 方法等。

( 3 ) 將蛋白質濃度調為 10 μg/μl。

( 4 ) 15000 g 離心 100 μl 樣品 10 min，沉淀膜或細胞器組分。

( 5 ) 用十二烷基 β-D-麥芽糖苷，Triton X-100 或洋地黃皂苷增溶液懸浮沉淀物（見注釋 1)。

( 6 ) 將懸浮液置于冰上 15 min。

( 7 ) 20000 g 離心 20 min，去除不容物。

( 8 ) 加入 5 μL 考馬斯亮藍染色液。

( 9 ) 直接加樣 50~100 μl 的上清液（相當于 0.5~1.0 mg 蛋白質）到 BN 膠上（蛋白質的定量為可被考馬斯亮藍染色，如用銀染，蛋白質量可減少到 1/10 )。

2. 水溶解組分

( 1 ) 按照標準方法制備要研究的水溶性蛋白質，所用的緩沖液不能含高鹽濃度或者離子去垢劑。蛋白質濃度要調節到 10 μg/μl。

( 2 ) 在 100 μl 樣品中加入 2 μl 考馬斯亮藍染色液。



( 3 ) 20000 g 離心 20 min，去除不溶物。

( 4 ) 直接加樣 50~100 μl 的上清液（相當于 0.5~1.0 mg 蛋白質）到 BN 膠上（如用銀染，減少蛋白樣品的加樣量，見 26. 3.1 節 1 中 第（a ) 步驟）。

3.2 BN-PAGE

如果電泳分離距離大于 12 cm，BN 凝膠就可以獲得最好的分辨能力。下面所介紹的方法是在 Bio-Rad 公司的 Protein II 電泳儀（Bio- Rad，Richmond，CA； 凝膠尺寸：0.15 cm X 16 cm X 20 cm) 上做的實驗，其他公司生產的電泳儀，如 HoeferSE-400 或 SE-600 電泳儀（GE  Healthcare,   Munich,   Germany) ，也同樣適用于  BN-PAGE 電泳。由于蛋白復合物的分子質量可從 50 kDa 到幾千 kDa，所以有時要用到梯度凝膠來分離 ( 見注釋 2) 。

( 1 ) 將 1.8 ml 丙烯酰胺溶液，3.3 ml BN 凝膠緩沖液，14.9 ml 雙蒸水混合在一起，配制成 4.5% 分離膠溶液。

( 2 ) 將 6.7 ml 丙烯酰胺溶液，3.3 ml BN 凝膠緩沖液，6.0 ml 雙蒸水，4 ml 甘油混合在一起，配制成 16% 分離膠溶液。

( 3 ) 將這兩種溶液分別灌入梯度生成器中，在這個梯度生成器上連接軟管和針頭，并與做膠的兩塊玻璃板之間的空間連接，這樣就可以從頂部灌膠（16% 分離膠溶液先灌進兩塊玻璃板之間），或從底部灌膠（4.5% 分離膠溶液先灌進兩塊玻璃板之間）。

( 4 ) 在這兩種凝膠溶液中加入 TEMED 和 APS  ( 90 μl 10% APS/9 μl TEMED 加入到 4.5% 分離膠溶液中；65 μl APS/6.5 μl TEMED 到 16% 分離膠溶液中）。

( 5 ) 灌梯度膠，在頂部為濃縮膠留一定的空間，用雙蒸水封膠液，凝膠將在 60 min 內聚合。

( 6 ) 倒掉雙蒸水。

( 7 ) 將 1.2 ml 丙烯酰胺溶液，2.5 ml BN 凝膠緩沖液，11.3 ml 雙蒸水混合在一起，配制成濃縮膠溶液。

( 8 ) 在濃縮膠溶液中加入 65 μl APS 和 6.5 μl TEMED，將其倒入插梳周圍的空間，濃縮膠將在 30 min 內聚合。

( 9 ) 稀釋相應的電泳緩沖液的濃縮儲液，分別制備成 1X 的陽極和陰極電泳緩沖液。

( 10 ) 當濃縮膠聚合后，小心移走插梳。

( 11 ) 將陽極和陰極電泳緩沖液分別加到電泳儀的上、下槽內，冷卻電泳儀到 4°C。

( 12 ) 將經考馬斯亮藍預處理的蛋白樣品加樣到凝膠凹槽里。

( 13 ) 將電泳儀與穩壓電源連接，一開始時，100 V 恒定電壓電泳 45 min，接著以 15 A 恒定電流電泳 8 h。要 在 4°C 電泳，電泳過程中可看到 BN 膠上的條帶。

3.3 第二相的 SDS-PAGE

1D BN-PAGE 分離的蛋白復合物可用考馬斯亮藍染色或銀染，用膠內酶學檢測了解其活性，或轉移到印跡膜進行進一步的分析（見注釋 3 和注釋 4) 。用第二相有 SDS 存在的凝膠電泳能分離出蛋白復合物的亞基組分，所有已發表的 SDS-PAGE 實驗方法都可與 BN-PAGE 結合，如 Laemmli 發表的電泳系統 [24] 。但是一般來說，Schagger 和 von Jagow [ 25 ] 開發的 Tricine-SDS-PAGE 系統的分辨率最高。下面所介紹的方法是在 Bio-Rad 公司的 Protein II 電泳儀（Bio-Rad， Richmond， C A；凝膠尺寸：0.15 cm X 16 cm X 20 cm) 上做的實驗，其他公司生產的電泳儀也同樣適用。

( 1 ) 剪下一條 BN 膠，室溫下將其浸泡在變性處理溶液中 30 min。

( 2 ) 用雙蒸水沖洗膠條 30~60 s ( 這一步驟很重要，因為 β-巰基乙醇抑制丙烯酰胺的聚合)。

( 3 ) 將膠條放在電泳儀的玻璃板上的正常膠梳的梳齒位置上。

( 4 ) 再用 1 mm 橡皮密封條、第二塊玻璃板和夾子等，組裝凝膠電泳儀。將所有需要的東西倒入灌膠器中（與第一向的膠條厚度（1.5 mm) 相比，減少第二向凝膠的厚度到 1.0 mm，以避免第二向膠條沿著垂直方向滑落下去）。

( 5 ) 將 10 ml 的丙烯酰胺溶液、10 ml 的 SDS 凝膠緩沖液、10 ml 雙蒸水、100 μl 的 APS 和 10 μl 的 TEMED 混合在一起，配制成 16% 分離膠溶液，將其倒入電泳儀兩塊玻璃板之間的 BN 膠條以下的空間，為嵌入 BN 膠條的樣品膠溶液留下空間。用封膠溶液封膠面，大約 60 min 內凝膠聚合。

( 6 ) 將 4.1 ml 的丙烯酰胺溶液、6.7 ml 的 BN 凝膠緩沖液、2 ml 甘油、200 μl 的 SDS 溶液、6.8 ml 雙蒸水、160 μl 的 APS 和 16 μl 的 TEMED 混合在一起，配制成 10% 樣品膠溶液。

( 7 ) 倒掉封膠溶液，倒入樣品膠將 BN 膠條嵌入，傾斜凝膠架子，使 BN 膠條下面的空氣釋放出來。

( 8 ) 分別在電泳儀的上、下槽加入 SDS 陽極和陰極電泳緩沖液。

( 9 ) 將電泳儀接上穩壓電源，30 mA 電流下，電泳過夜。

作為一個替代系統，第二向電泳可在天然條件下進行（ 見注釋 7) 。

3.4 染色

用所有的標準蛋白質染色方法可以顯色 2D BN 凝膠上分離的蛋白質，如考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染料染色等。如果接著用質譜儀鑒定蛋白質，建議使用考馬斯亮藍染色，下面介紹由 Nenhoff 等開發的基于膠態考馬斯亮藍染色的實驗指導。

( 1 ) 將凝膠在固定液中固定處理 1 h。

( 2 ) 混合 80 ml 新鮮配制的染色液和 20 ml 乙醇溶液。

( 3 ) 將凝膠浸泡在上述溶液中過夜。

( 4 ) 用雙蒸水沖洗凝膠，脫色，要中途換水直至背景清晰（如果背景顏色無法用水脫除，可使用 20% 的乙醇溶液脫色）。