(1)選擇 SPE 小柱或濾膜
首先應根據待測物的理化性質和樣品基質,選擇對待測物有較強保留能力的固定相。若待測物帶負電荷,可用陰離子交換填料,反之則用陽離子交換填料。若為中性待測物,可用反相填料萃取。SPE 小柱或濾膜的大小與規格應視樣品中待測物的濃度大小而定。對于濃度較低的體內樣品,一般應選用盡量少的固定相填料萃取較大體積的樣品。
(2)活化
萃取前先用充滿小柱的溶劑沖洗小柱或用 5～10mL 溶劑沖洗濾膜。一般可先用甲醇等水溶性有機溶劑沖洗填料,因為甲醇能潤濕吸附劑表面,并滲透到非極性的硅膠鍵合相中,使硅膠更容易被水潤濕,之后再加入水或緩沖液沖洗。加樣前,應使 SPE 填料保持濕潤,如果填料干燥會降低樣品保留值;而各小柱的干燥程度不一,則會影響回收率的重現性。
(3)加樣
①用0.1 mol/L 酸或堿調節,使 pH<3或 pH>9,離心取上層液萃取;
②用甲醇、乙腈等沉淀蛋白質后取上清液,以水或緩沖液稀釋后萃取;
③用酸或無機鹽沉淀蛋白質后取上清液,調節 pH 值后萃取;
④超聲 15min 后加入水、緩沖液,取上清液萃取。尿液樣品中的藥物濃度較高,加樣前先用水或緩沖液稀釋,必要時可用酸、堿水解反應破壞藥物與蛋白質的結合,然后萃取。流速應控制為2～4mL/min,流速快不利于待測物與固定相結合。
(4)清洗填料
反相 SPE 的清洗溶劑多為水或緩沖液,可在清洗液中加入少量有機溶劑、無機鹽或調節 pH 值。加入小柱的清洗液應不超過一個小柱的容積,而 SPE 濾膜為5～10mL。
(5)洗脫待測物
應選用5～10mL 離子強度較弱但能洗下待測物的洗脫溶劑。若需較高靈敏度,則可先將洗脫液揮干后,再用流動相重組殘留物后進樣。體內樣品洗脫后多含有水,可選用冷凍干燥法。保留能力較弱的 SPE 填料可用小體積、較弱的洗脫液洗下待測物,再用極性較強的 HPLC 分析柱如 C18 柱分析洗脫物。若待測物可電離,可調節 pH 值,抑制樣品離子化,以增強待測物在反相 SPE 填料中的保留,洗脫時調節pH值使其離子化并用較弱的溶劑洗脫,收集洗脫液后再調節 pH 值使其在 HPLC 分析中達到最佳分離效果。在洗脫過程中應減慢流速,用兩次小體積洗脫代替一次大體積洗脫,回收率更高。