高效離子色譜柱研究

離子色譜（IC）發展已經有四分一個世紀，作為一種獨立的色譜分枝，并在許多領域得到廣泛應用。
但離子色譜（IC）與其相似的色譜高效液相色譜（HPLC）相比，柱效要低很多（約為HPLC的1/3），而價格則要高很多（約HPLC的3到5倍）。
提高離子色譜的柱效，是離子色譜研究急需解決的問題，也將是推動離子色譜發展和應用的決定因素之一。
離子色譜柱效不高的原因
離子色譜采用抑制器（目前大部分離子色譜采用雙柱型），抑制器產生死體積會使色譜峰擴散，這對弱保留離子特別明顯。
離子色譜柱一般采用聚合物柱（如，國際上最好的離子色譜柱Dionex IonPac類)，與無機填料相比，聚合物柱剛性比較差，易收縮，因此同樣的大小填料，聚合柱往往柱壓比較高。
但硅膠型填料由于無法耐受強堿性淋洗液，使它在離子色譜柱應用受限制，雖然，曾有人嘗試碳柱、鋯柱、氧化鋁柱，但實際效果并不理想。

涂覆型離子色譜柱
聚合物或者硅膠基反相填料，通過靜態、動態涂覆表面活性劑、染料和乳膠，可制備成離子色譜柱（如季胺鹽表面活性劑可以制備成陰離子色譜柱）。
涂覆型離子色譜柱的特點是簡單、方便，價格便宜，也可以反復涂覆使用。
缺點是于色譜的柱容量不易控制（一般柱容量偏高），柱效也不高（一般報道在6400~10000理論塔板數/M），另外，還存在使用壽命問題。
但對新型色譜柱研制往往先從涂覆型開始然后再化學鍵合。
我們的工作
采用動態和靜態涂覆陽離子（季胺鹽類）表面活性劑等方式，對反相色譜柱和填料進行涂覆，制備陰離子色譜柱。
在涂覆過程中，添加非離子表面活性劑，從而控制陰離子色譜柱的柱交換容量，縮短被測物的保留時間。
控制涂覆過程，提高陰離子色譜柱的柱效。
對有關的機理進行研究，為一下研制高效離子色譜柱打下基礎。
實   驗
試劑
    乙腈采用Merck (Darmstadt,Germany)的HPLC級。其它淋洗液和被測物標準均為分析純，購自Aldrich (Milwaukee, WI, U.S.A.)或Ajax (Auburn, N.S.W. Australia)。全部溶劑配制包括淋洗液和標準溶劑均采用Millipore Mill-Q純水系統（Millipore,  Milford, MA, U.S.A.)的二次去離子水配制。
2、儀器
        離子色譜采用Dionex (Sunnyvale CA,U.S.A.) DX600型，配以GS50梯度泵，AS50柱溫箱，AS50自動進樣器, UI 20通過接口，和 Waters 484可變波長紫外檢測器.  數據采用和處理采用Peaknet 6.2 軟件。色譜柱分別采用Dionex IonPac NS1 (150 x 4 mm, ID) 聚合物柱，Dionex Acclaim 120 C18 (100 x 4.6 mm, ID), Waters (Milford, MA, USA) Nova-Pak C18 (150 x 3.9mm, ID), Phenomenex (Torrance, CA, USA) Synergi 4μ MAX-PR 80? C12 (150 x 4.6 mm, ID), 和CERI (Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan) L-column ODS (150×4.6mm,ID)，抑制器采用Dionex AMMS-UTRA 4mm自再生抑制器。

涂覆和分析過程
動態涂覆商品化反相柱采用，5mM 雙十二烷基雙甲基溴化(DD), 5 mM 十六烷基吡啶(CPC), 或5 mM 非離子表面活性劑(曲拉通 X100, 吐溫20或Brij 35)以1 ml/min涂覆滅色譜柱1―2小時.也可能混合非離子和陽離子表面活性劑進行涂覆，如果有要求，可以串接紫外檢測器在200nm下檢測。
靜態涂覆采用5μm的Dionex大孔聚合物填料，加入20mM DD和一定濃度非離子表面活性劑，超聲后，用均漿法裝柱。
DD涂覆柱采用5.0 mM 高氯酸鈉以2.0 ml/min淋洗UV 200nm下檢測，其它涂覆柱采用1 ml/min流速用 10 mM碳酸鈉或2 mM高氯酸鈉淋洗，抑制電導或紫外檢測。
涂覆柱用淋洗液沖洗，平衡后進樣分析測試。抑制采用循環方式，抑制電流為 50 mA 。
保留因子, k’,計算如下: k’=(tr-t0)/t0。這里t0, 是系統死時間，tr是被測物的保留時間。峰的不對稱性(A)的計算如下=(RW5%+LW5%)/(2xLW5%), 這里RW5% and LW5% 分別是5%峰高時左邊和右邊的峰寬。理論塔板數用半峰寬方法計算。
結果與討論 所用非離子和陽離子表面活性劑
混合陽離子和非離子表面活性劑涂覆反相柱
與常規的涂覆方法不同，采用非離子表面活性劑與陽離子表面活性劑，可以有效控制陰離子色譜柱的交換容量。
動態涂覆商品化反相柱（包括聚合物和硅膠柱）和靜態涂覆填料，得到結果是相似的。
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下圖單純涂陽離子表面活性劑與混合非離子表面活性劑涂覆的比較。
單純涂陽離子表面活性劑的色譜柱
Conditions: column: L-column ODS coated with 5 mM  DD; eluent: 5 mM NaClO4 ;  flow rate, 2.0 ml/ min; detection, UV at 200 nm; sample: 100L Peaks:
1. 30 g/ml 醋酸,
2.  2 g/ml 亞硝酸,
3.  2 g/ml 溴,
4. 2 g/ml 硝酸
5. 2 g/ml 4-羥基苯甲酸，
6. 30 g/ml 草酸,
7. 30 g/ml 鉬酸根,
8. 10 g/ml 苯甲酸,
9. 10 g/ml 鄰苯二甲酸,
10. 30 g/ml 硫氰根
混合涂非離子和陽離子表面活性劑的色譜柱
Same conditions as last Fig except the column was coated with a mixture of 5 mM DD and 2 mM Tween 20.  Peak:  
醋酸,
亞硝酸,
溴,
硝酸,
草酸,
4-羥基苯甲酸,
鉬酸,
碘,
鄰苯二甲酸,
苯甲酸
硫氰酸根.
不同比較的非離子和陽離子表面活性劑涂覆柱測定離子保留時間比較
混合表面活性劑涂覆滅存在的問題
混合表面活性劑涂覆柱還存在如下問題：
非離子表面活性劑量在適度，否則會出現色譜柱疏水性過強，對強疏水性離子（如苯甲酸類），超過一定量的非離子表面活性劑再增加非離子表面活性劑，反而會增加保留時間。
雖然，加入了非離子表面降低了色譜柱交換容量，但色譜柱效并沒有改變。
柱壓會隨著涂覆而大大增加。
多層涂覆的高效陰離子色譜柱
考慮到色譜柱涂層的可能情況，我們采用了雙層涂覆的方式，即先涂非離子表面活性劑，然后再涂陽離子表面活性劑。或者次序相反。
通過雙層涂覆，我們可以得到非常高效的陰離子色譜柱，其理論塔板數達到約80000/M，考慮到離子色譜柱抑制器擴散，其柱效與HPLC柱基本一致。
這種方式涂覆，不同的非離子表面活性劑均有效，但所試的表面活性劑中曲拉通X-100最有為效。
下面是幾種柱涂覆后的色譜分離圖。

Dionex Acclaim 120 C18 5 m 120 ? (4.6 x 100 mm, ID) 涂覆柱的常規陰離子分離
Conditions:  column:  Dionex Acclaim 120 C18 5 m 120 ? (4.6 x 100 mm, ID) coated first with 5 mM Triton X-100 and then 5 mM CPC; eluent: 10 mM Na2CO3; flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity with suppressor operated at 50 mA in the recycle mode; sample:  50 μL
Peak:
1. 2 μg/ml 氟,
2. 10 μg/ml 甲酸,
3. 5μg 氯,
4. 5 μg/ml 亞硝酸,
5. 10 μg/ml 磷酸,
6. 5 μg/ml 溴,
7. 10 μg/ml 硫酸,
8. 20 μg/ml 草酸.
9. 5 μg/ml 硝酸,
10.  20 μg/ml 4-羥基苯甲酸

乙酸及氟代乙酸的分離
Conditions:  column:  Dionex Acclaim 120 C18 5 m 120 ? (4.6 x 100 mm, ID coated first with 5 mM Triton X-100 and then 5 mM CPC; eluent: 10 mM Na2CO3; flow rate, 1.0 ml/min; detection by suppressed conductivity with suppressor operated at 50 mA in the recycle mode; sample:  50 μL
Peak:
1. 10 μg/ml 乙酸,
2. 10 μg/ml一氯乙酸
3. 10 μg/ml二氯乙酸
4. 50 μg/ml三氯乙酸
Waters Nova-Pak C18  (150 x 3.9 mm)涂覆柱的常規陰離子分離
Conditions:  column:  Waters Nova-Pak C18  (150 x 3.9 mm, ID) coated first with 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPC; eluent:  10 mM Na2CO3; flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity operated at 50 mA in the recycle mode; sample: 50 μL
Peak:
1. 2 μg/ml 氟
2. 10 μg/ml 甲酸
3. 5 μg/ml 氯
4. 5 μg/ml 亞硝酸
5.10 μg/ml 磷酸
6. 5 μg/ml 溴
7.10 μg/ml 硫酸
8. 20 μg/ml 草酸
9. 5 μg/ml 硝酸
10. 20 μg/ml 4-羥基苯甲酸
Phenomenex Synergi 4 μm MAX-PR 80 ? (4.6 x 150 mm)涂覆柱的陰離子分離紫外檢測
Conditions:  column:  Phenomenex Synergi 4 μm MAX-PR 80 ? (4.6 x 150 mm, ID) coated first with 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPC; eluent:  2 mM NaClO4, flow rate, 1.0 ml/min; detection, UV detection at 210 nm; sample:  50 μL
Peak:
1.  30 μg/ml 乙酸,
2.  2 μg/ml 亞硝酸,
3.  2 μg/ml 溴,
4.  2 μg/ml 硝酸,
5.  30 μg/ml 草酸,
6.  10 μg/ml 碘
7.  2 μg/ml 4-羥基苯甲酸
8.  30 μg/ml 鉻酸,
9.  30 μg/ml 硫氰酸.
10. 10 μg/ml 鄰苯二甲酸,
11. 10 μg/ml 苯甲酸,

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各類離子色譜柱效的比較
重現性和使用壽命
與單層涂覆柱相比，雙涂覆柱有更好的重現性，比較理想的使用壽命。
重現性: RSD of tR(n=13)<3%
使用壽命: >1 month for >12 h/day
已經應用于: 自來水、肥料、植物的陰離子測定
肥料樣品中陰離子的測定
Conditions:  column:  Phenomenex Synergi 4 μm MAX-PR 80 ? (4.6 x 150 mm, ID) coated with at first 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPCl; eluent:  5 mM Na2CO3 /X, flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity with regenerate current of suppressor is 50 mA with recycle mode; sample:  50 μL.
植物樣品中陰離子的測定
Conditions:  column:  Phenomenex Synergi 4 μm MAX-PR 80 ? (4.6 x 150 mm, ID) coated with at first 5 mM Triton X-100 with 30% ACN and then 5 mM CPCl; eluent:  5 mM Na2CO3/X, flow rate, 1.0 ml/min; detection, suppressed conductivity with regenerate current of suppressor is 50 mA with recycle mode; sample:  50 μL.
可能的機理
先涂陽離子表面活性劑，然后再涂非離子表面活性劑，得到的色譜柱基本沒有離子交換容量，說明色譜涂層呈兩層狀態。
雙層涂覆對聚合物柱并沒有柱效提高，可能是聚合物柱疏水性太強，非離子表面活性劑層作用不大。
提高離子色譜柱效原因可以認為是表面涂上非離子表面活性劑，使陽離子表面活性劑層表面更均勻和更薄，加速了離子交換的平衡。
可能的涂覆示意圖，詳細的機理還有待進一步探討。
僅涂覆陽離子表面活性劑示意圖
先涂覆非離子表面活性劑
再涂覆陽離子表面活性劑
涂覆型色譜柱問題
涂覆型色譜柱使用壽命一般為幾個月，但可以反復涂覆。
硅膠型反相柱，一般不耐強堿性淋洗液，對于陰離子分離，常規的碳酸鈉和氫氧化鈉淋洗液會使色譜柱壽命縮短。
柱壓會隨著涂覆而大大增加。
下一步工作
解決柱壓高和使用壽命問題，采用化學鍵合。
解決硅膠型反相柱的耐堿性問題，采用新型的固定相和流動相。
對高效離子色譜柱的機理進一步探討。