3HTdR摻入法檢測IL2的生物活性

實驗概要

本實驗應用³H-TdR摻入法檢測了IL-2的生物活性。

主要試劑

1. 10% Fcs-RPMI-1640完全培養液

2. ³H-TdR

3. IL-2標準品：倍比稀釋為不同濃度

主要設備

96孔培養板，刻度吸管，毛細吸管，刻度離心管，離心機，加樣器(頭)，細胞計數板，倒置顯微鏡，超凈工作臺，CO₂培養箱，微量細胞收集儀，玻璃纖維濾紙，?液閃計數儀

實驗材料

1.反應細胞：CTLL-2，存活率應＞95%

2.待測樣品：倍比稀釋為不同濃度

實驗步驟

1.用10 %FCS-RPMI-1640培養液洗滌CTLL-2細胞2次，1000r/min離心5min，以去除原生長培養液(含IL-2)；

2.用10% Fcs-RPMI-1640培養液調細胞濃度為1×10⁵/ml；

3.將不同倍比稀釋度的IL-2的標準品和待測樣品分別加入96孔細胞培養板，100μL/孔，各設3復孔，同時設培養液對照；

4.各孔均加入CTLL-2細胞懸液，100μl/孔；

5.置37℃，5%CO₂培養箱中培養24h；

6.每孔均加入³H-TdR，0.5μci/孔，繼續培養4-6h；

7.用微量細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維紙上，用?液閃計數儀測定各孔cpm值。測定CPM值的最佳時間應是培養液對照(無IL-2)細胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細胞生長旺盛時。

注意事項

用¹²⁵I-UdR代替3H-TdR進行IL-2活性檢測。其優點是不需?液體閃爍測定所需的試劑和設備，只需一臺小型γ計數儀即可，并可節省時間和減少?液體閃爍操作中出現的誤差。其缺點是¹²⁵I-UdR半衰期較短，需要定期供應。基本方法同³H-TdR摻入法，只是用¹²⁵I-UdR代替³H-TdR，0.2μci/孔，然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl，繼續培養24h，收集細胞用γ計數儀測定cpm值。