5000bp！單分子測序讀長再次升級

　　PacBio RS單分子測序在發布時就以其超長的讀長引起研究者的極大興趣。在不到一年的時間里，隨著年初C2試劑的升級，Pacbio RS的平均讀長達到了3000bp，并迅速在測序的各個領域，特別是De novo中發揮了巨大的讀長優勢。Pacific Biosciences公司在11月6日正式發布新的超長測序試劑：XL系列。該試劑將主要針對De novo應用，平均讀長將達到5000bp，其中5%的讀長將超過13000bp，最長超過20000bp。美國冷泉港實驗室前期試用于水稻基因組的組裝，得到9倍覆蓋率的長片段讀序中50%在4800bp以上，大大提高了其通過NGS mate-pair拼接的程度。相信隨著該新試劑的正式全面投入使用，將會對現有基因組的完善帶來更大的突破。

　　對于研究者所關心的一些問題，我們也聯系了Pacific Biosciences公司的技術支持，并一一做了解答。

　　問：XL試劑有哪些更新?

　　答：XL 試劑采用了新的DNA聚合酶，合成速度更快，能夠獲得超長的讀長，非常適合如De novo這樣的應用。目前XL試劑可以獲得平均5000bp的讀長，5%的讀長可以超過13000bp。不僅如此，XL試劑中的DNA聚合酶采用了熱啟動合成方式。這樣就可以檢測到在文庫接頭(adaptor)附近的序列，從而獲得更長的讀長。在非熱啟動方式下，合成反應開始的大約1000-2000bp 的堿基由于反應太快來不及被檢測到，而熱啟動方式可以使檢測器在合成起始時就可以很快的檢測到堿基信號。

　　問：新試劑的升級是否需要改變現有的實驗流程，如建庫的方法?

　　答：不需要。XL試劑適用于構建10kb以上的模板庫，我們之前已經有詳細的protocol用于構建這樣的模板庫，所以用戶只需要按照實驗流程進行操作，換用新的試劑而已。

　　問：XL試劑最主要適合于哪些應用?

　　答：XL試劑在研發時主要用于de novo組裝時產生長的讀長，與PacBio 的CCS(環形比對讀序)或用戶已有的二代測序的組裝數據進行混合拼接，加速完成完整基因組。廠家會隨試劑附詳細的XL試劑的應用說明。

　　問：是否可以用XL試劑進行堿基修飾和motif分析?

　　答：可以!XL試劑讀序數據完全可以應用于堿基修飾測定。這也是PacBio RS第三代測序不同與其它測序系統獨特的應用，最新版軟件可以自動識別6- m A，4- m C和Tet轉換的5-mC并進行甲基轉移酶識別motif分析。PacBio在這方面一直在加緊開發完善相關配套數據庫和軟件，以不斷增加更多軟件能夠自動識別判定的堿基修飾種類和motif分析。PacBio跟New England Biolabs合作關于細菌甲基化組的研究報道已在十月的《核酸研究》上發表(http://nar.oxfordjournals.org /content/early/2012/10/02/nar.gks891.full )， 不僅可以在基因組水平上研究甲基化圖譜，還可以精確研究對應的甲基轉移酶及其識別的motif。

　　問：XL試劑的升級是否需要硬件升級?是否需要額外的費用?

　　答：不需要硬件升級和額外費用!從PacBio去年二季度正式推出第三代測序系統至今，PacBio在不斷提升測序品質和性能的同時都保持著儀器系統的一致性和兼容性，讓用戶免費得到各項升級，及時便捷地使用到第三代測序最新的技術和成果。

　　問：XL試劑是否會取代C2試劑?

　　答：XL 試劑是作為C2試劑的補充，主要針對諸如De novo組裝這樣需要超長讀長的應用，超長讀長能夠確定變異的單倍體型，跨越長的各級重復區域，解析轉錄本可變剪切及拼接，大大提高解讀復雜基因組和轉錄組的能力。而現有的C2試劑可以針對不同應用需求制備不同長度(250bp-10kb)的文庫，二者并不沖突。因此，XL并不會取代現有的C2試劑。而正式的C3試劑(C2的升級版)預計會在明年推出。

　　問：使用C2試劑，系統可以記錄單個90分鐘時長的movie，或者兩個45分鐘時長的movie，那么XL試劑呢?

　　答：使用XL試劑可以記錄單個120分鐘時長的movie，或者兩個55分鐘時長的movie。

　　在此，我們已經初步了解了Pacific Biosciences公司即將發布的XL試劑升級的一些信息。PacBio公司Dr. Korlach也將在11月8日美國舊金山的ASHG (American Society for Human Genetics ) 年會上介紹該最新產品。同時，PacBio RS第三代測序用戶如加州大學戴維斯分校的Dr. Paul Hagerman，斯坦福大學的Dr. Hagen Tilgner ，猶他州大學的Dr. David Witherspoon 等也將在該會議上交流第三代測序在脆性X染色體綜合癥，真核轉錄組分析，人的激活的LINE-1元件的動態掃描 (Mobile-Element Scanning )等應用中的最新進展和成果。我們會跟蹤更多詳細的內容，后續報道。