ACE HILIC色譜柱檢測器兼容性
HILIC是一種能很好兼容眾多主流檢測器的技術。因此,檢測的(檢測器的)選擇受檢測器可用性、所需的檢測限制和分析物的理化特性(即:具有發色團或電荷)等綜合因素的影響。
UV-Vis檢測器
UV-Vis檢測器是分析試驗室中最常見的檢測器之一。
根據儀器的不同,一次可記錄多個波長,以優化分析物覆蓋范圍。
有時,混合物中的分析物可通過參考紫外光譜庫來快速識別。
圖10中的例子示出了五種β受體阻滯劑的分離,這些阻滯劑可通過他們不同的圖譜清楚識別(識別清楚)。

圖10
五種β受體阻滯劑的色譜圖和紫外光譜
色譜柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流動相:10 mM甲酸銨pH3.0(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
溫度:25 °C
檢測:UV, 214 nm
樣本:
1) 普萘洛爾
2) 醋丁洛爾
3) 索他洛爾
4) 沙丁胺醇
5) 阿替洛爾
折射率檢測器
示差折光測器(RID)測量當通過檢測器時分析物峰相對參考溶劑(即流動相)的折射率。如果這二者之間存在差別,色譜圖中可觀察到峰。
RID對缺乏活性發色團的分析物很有用,尤其常用于糖分分析。
RID存在幾個方面的劣勢。這些劣勢包括靈敏度受限和沒有峰相關的信息(峰的身份通常需要單獨的標準來驗證)。
此外,RID只能用于等度條件,因為洗脫劑(洗脫劑組成變化)會改變折射率響應。
作為物理測量,折射率也很受溫度的影響,也就是說,基線噪聲和再現(重現)性會發生變化。
蒸發光散射檢測器
蒸發光散射檢測器(ELSD)通過如下方式工作:從LC上噴射輸出洗脫液與惰性氣體(通常為氮氣),以形成液滴在加熱室內去溶劑化。
去溶劑化后的分析物被分散的光源擊中,然后進行檢測(噴射出惰性氣體來霧化從LC中輸出的洗脫液,形成液滴后在加熱管中蒸發,去溶劑的分析物被分散的光源擊中然后進行檢測)。
探測器(ELSD)需要揮發性洗脫劑,以使HILIC非常適合(HILIC方法就非常適合這款檢測器)。ELSD是RID有效的替代選擇,因為它非常適合非(無)發色團分析物,靈敏度更高,并且適用于梯度色譜法。
但是,ELSD不提供光譜信息,因此在沒有標準的情況下,較難識別峰值(峰的識別很困難)。
對于HILIC分離(分析物),ELSD對發色團有限(有限發色團)的極性分析物更有利,例如甲基丙二酸(MMA)和琥珀酸(圖11)。
MMA用作維生素B12缺乏癥的生物標志,但琥珀酸與MMA等壓(元素相同),因此必須徹底解決以防止假陽性結果。
采用ELSD的HILIC法,其MMA量化比紫外線檢測法更好。

圖11
甲基丙二酸和琥珀酸的色譜圖
色譜柱:ACE 5 HILIC-B,
150 x 4.6 mm
流動相:10 mM
甲酸銨pH3.0(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
溫度:25 °C
檢測:ELSD
樣本:
1) 琥珀酸
2) MMA
質譜儀
質譜儀(MS)是LC分離中信息最豐富的檢測技術。
LC的洗脫劑流通常使用惰性氣體(如氮氣)去溶劑化(LC流出的洗脫液在加熱管中被惰性氣體去溶劑化),并在檢測前電離。
可使用不同的質譜分析儀,如:四極質譜儀、飛行時間質譜儀、離子阱質譜儀等。有機物含量較高的HILIC洗脫劑特別適合MS檢測。
有多個電離源可用,根據具體應用進行選擇。
噴霧電離質譜(ESI)很常用,但也使用電暈放電和光電離源。MS具有高度專一性,因為可利用選擇性離子檢測(SIM)進行跟蹤(因為可以使用選擇離子性監測來跟蹤單個物質的荷質比(m/z),得到更好的選擇性),提高靈敏度。MS還可以在不同質量范圍內執行掃描,這對未知的樣本(樣品)很有幫助。
但是,MS掃描通常靈敏度小得多。(具有更小的靈敏度。)
MS可用于檢測發色團較弱或者沒有發色團的分析物。
作為一種識別工具,MS對HILIC應用也很有幫助,這種應用中分析物具有相似的紫外光譜特性,但質量不同(在HILIC應用中,當分析物具有相似的紫外光譜特性,但質量不同,MS是很有用的識別工具)。
核酸堿基和核苷就是一個很好的HILIC例子。極性分析物腺嘌呤、腺苷和2’-脫氧腺苷的紫外光譜非常相似(圖12)。

圖12
腺嘌呤、腺苷和2’-脫氧腺苷的紫外光譜對比
藍色軌跡:腺嘌呤
紅色軌跡:腺苷
綠色軌跡:2’-脫氧腺苷
色譜柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流動相:10 mM甲酸銨,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
溫度:25 °C
檢測:UV
進樣量:2 μL
MS可利用這些分析物不同的質荷比進行檢測和識別峰(圖13)。SIM用于提高靈敏度。

圖13
利用UV和MS聯合檢測法分析ACE HILIC-N的腺嘌呤和核苷
(a)下列物質的紫外光色譜圖:
1) 2’-脫氧腺苷(m/z 252.4)
2) 腺嘌呤(m/z 136.1)
3) 腺苷(m/z 268.3)
(b) 通過MS SIM確認峰
色譜柱:ACE 5 HILIC-N,150 x 4.6 mm
流動相:10 mM甲酸銨,pH4.7(溶于MeCN/H2O中)(90:10 v/v)
流速:1.5 mL/min
溫度:25 °C
檢測:UV,254nm和MS
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