DNA分子雜交的基礎是，具有互補堿基序列的DNA分子，可以通過堿基對之間形成氫鍵等，形成穩定的雙鏈區。
在進行DNA分子雜交前，先要將兩種生物的DNA分子從細胞中提取出來，再通過加熱或提高pH的方法，將雙鏈DNA分子分離成為單鏈，這個過程稱為變性。然后，將兩種生物的DNA單鏈放在一起雜交，其中一種生物的DNA單鏈事先用同位素進行標記。
如果兩種生物DNA分子之間存在互補的部分，就能形成雙鏈區。
由于同位素被檢出的靈敏度高，即使兩種生物DNA分子之間形成百萬分之一的雙鏈區，也能夠被檢出。
