實驗方法原理
進行Southern雜交分析時應標記不帶載體的插入片段作為探針,常用的標記方法耗時很長,它包括將質粒或λDNA經限制性內切酶酶解后分離插入片段,用切口平移法或隨機引物標記法進行標記。相比之下,采用PCR聚合酶鏈式反應法標記探針有幾個優點,只需極少量的質粒DNA(50ng)作模板即可擴增出大量高效標記的插入片段。在PCR反應中加入非放射性的替換核苷酸(生物素dUTP,地高辛-11-dUTP堿不穩定型),可在數小時內合成大量標記好的探針
實驗材料 LB培養基psr142引物FBA065引物dATP、dGTP、dCTP溶液Taq聚合酶
試劑、試劑盒 待標記的 DNA 探針
儀器、耗材 PCR儀電泳槽及電源微量移液器及相應吸頭1.5mlEppendorf管5ml溶血管臺式微量離心機37℃恒溫搖床恒溫水浴鍋-20℃冰箱-80℃冰箱4℃冰箱
實驗步驟
1.在一加有1mL LB-抗生素培養基的5mL溶血管中接種一單菌落,松松地蓋上管帽,37℃劇烈振蕩培養過夜。
2.取800μL菌液至一1.5mLEppendorf管中。臺式離心機12000r/min離心30s。余下的菌液于4℃保存或加入40μL滅菌甘油混勻于-80℃保存。
3.棄上清液。用400μL 1%TritonX-100劇烈振蕩重懸菌體沉淀。
4.菌體懸浮液煮沸5min后于冰上放置5min。細菌裂解液置于4℃或-20℃保存。
5.取一微量擴增反應管,加入以下試劑至終體積50μL:
25μL滅菌蒸餾水
10μL50%滅菌甘油
5μL 10×PCR反應緩沖液
0.5μL 5mmoL/LdATP
0.5μL 5mmoL/LdCTP
0.5μL 5mmoL/LdGTP
1μL 2mmoL/LdTTP
1μL 0.2mmoL/L地高辛-11-dUTP堿不穩定型
0.625μL 20μmoL/L引物1
0.625μL 20μmoL/L引物2
0.25μL 5U/μLTaq聚合酶
5μL細菌裂解液
6.按以下參數進行PCR擴增
1個循環:94℃,1min
35個循環:94℃,15s
48℃,30s
72℃,3min
1個循環:72℃,7min
7.取3μLPCR擴增產物進行水平瓊脂糖凝膠電泳,用已知濃度的標準DNA作對照估算擴增產物的濃度。余下的PCR擴增產物置于4℃保存。
注意事項
其他
采用非同位素法檢測的優點主要有:
(1)降低了實驗操作者的危險,實驗廢物無需專門處理,從而可以處理大批RFLP分析的樣品。
(2)可標記多個、大量探針以備日后之需。標記好的探針可置于-20℃保存(至少一年)。
(3)在進行RFLP分析時,化學熒光檢測系統的探針、CSPDR和膜均可重復使用(分別為3～5次、3～5次、5～8次或更多)。與同位素檢測方法相比更為經濟。
(4)實驗安排更為方便。因為無需像使用32P時那樣要受同位素的衰減時間限制。
(5)室溫下曝光即可,無需使用增感屏或-80℃冰箱。
(6)曝光時間短(幾小時),也就是說一張膜每3d即可重新雜交一次
試劑說明：
1.LB培養基(1%胰蛋白酶,1%NaCL,0.5%酵母抽提物,pH7.0),抗生素,1%TritonX-100,滅菌超純水,50%滅菌甘油,10×PCR反應緩沖液(0.1moL/LTris-HCL,pH8.3;15mmoL/LMgCL2;0.5moL/LKCL;1mg/mL明膠);
2.psr142引物:
20μmoL/L反向引物:5 ATTCGAGCTCGGTACC 3
20μmoL/L正向引物:5 AGGTCGACTCTAGAGG 3
3.FBA065引物:
20μmoL/L反向引物:5 AACAGCTATGACCATG 3
20μmoL/L正向引物:5 GTAAAACGACGGCCAGT 3
4.5mmoL/LdATP、dGTP、dCTP溶液,2mmoL/LdTTP溶液,0.2mmoL/L地高辛-11-dUTP(堿不穩定型),5U/μLTaq聚合酶。