DNA連接酶及其應用

（一）DNA連接酶的發現

環形DNA分子的發現使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。

首個DNA連接酶(ligase)——大腸桿菌DNA連接酶，是1967年發現的，是大腸桿菌基因編碼。

1970年，發現了T4DNA連接酶，由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。

（二） DNA連接酶作用特點

1. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3’－OH和5’－P，而且這兩個基團彼此相鄰；

2. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。

E.coli DNA連接酶 －連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），現在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。

T 4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端，需ATP輔助因子，活性高，常用。

（三） DNA連接酶的反應條件

影響連接效率的因素有：

1. 溫度（通常在4-15℃ ）

2. ATP的濃度(10μM／L - 1mM／L )

3. 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，黏性末端僅需0.1U）

4. 反應時間（通常連接過夜）

5. 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）

（四）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案

1．連接反應一般在滅菌的0.5ml離心管中進行。

2．10μl體積反應體系中：取載體50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般線性載體DNA分子與外源DNA分子摩爾數為1∶1～5∶1），補足ddH2O 至8μl。

3．輕輕混勻，稍加離心，56℃水浴5min后，迅速轉入冰浴。

4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA連接酶合適單位， 用ddH2O 補至10μl，稍加離心，在適當溫度（一般14-16℃）連接8-14hr。