DNA酶I足跡分析實驗

32P-標記 DNA 酶 I 足跡探針酚 氯仿乙醇聚乙烯醇競爭 DNA 緩沖液Z'(或緩沖液 Ze）DNA 酶 IMgCl2(10 mmol L) CaCl2(5 mmol L)DNA 酶 I 終止液蛋白酶 K甲酰胺加樣緩沖液

材料

³²P-標記 DNA 酶 I 足跡探針

酚/氯仿（1:1;v/v)

乙醇（100% 和 75%;v/v)

試劑

聚乙烯醇（10%;w/v)

競爭 DNA

緩沖液 Z'(或緩沖液 Ze）

DNA 酶 I(2,5 mg/ml)

MgCl₂(10 mmol/L)/CaCl₂(5 mmol/L)

DNA 酶 I 終止液

蛋白酶 K(2.5 mg/ml)

甲酰胺加樣緩沖液

(配方，見“試劑的配制”，PP.131~138)

操作程序

1)1.5-ml 塑料微量離心管置冰上預冷。加入 DNA 酶 I 終止液前可不必蓋蓋，（見步驟 11,P.124)

2) 按如下配方配制供所有反應用的組合探針 DNA 混合物：

1X 探針 DNA 混合物（用于一次反應)

³²P-標記 DNA 探針                                                                                   Xul

聚乙烯醇 (10%)                                                                                         10ul

小牛胸腺 DNA(1 mg/ml);poly(dI-dC)、poly(dG-dC)、                                0.2~1ul

或 poly(dA，dT)(10A_260nm 單位；或不含競爭 DNA(用于

純的或近似純的蛋白質)。對 S-300 柱組分（10ul), 用

(0.2ul10A260nm 單位 poly(dI-dC)

H₂0                                                                                                             Zul

總體積                                                                                                         25ul

震蕩，使探針 DNA 混合物徹底混勻。聚乙烯醇較粘稠，只有充分震蕩才能使探針 DNA 溶液完全混合。
注：1. 聚乙烯醇可能會促進因子與 DNA 的結合。它大概是作為“分子擁擠劑（molecularcroudingagent)"而起作用的，分子擁擠劑 [”體積排阻劑（volumeexcluder)“] 可加大分子如蛋白質和 DNA 的有效濃度（可把它想象成分子海綿，它只吸水和小離子而不吸大分子 2. 競爭 DNA 可用可不用，但分析粗制的蛋白質組分時，用競爭 DNA 常常是有益的。
注意，加入競爭 DNA 的時間可能是一個重要參數。一般，競爭 DNA 與探針混合物一起加人，如本方案中 AP-1 的足跡分析。不過，在某些情況下，加入蛋白質組分和探針混合后再在毎個管中分別加入競爭 DNA, 可能會更好座。加入競爭 DNA 的最適時間應由實驗定。

3) 于每個反應管中加入適量的緩沖液 Z'十 0.1mol/LKC1 和緩沖液 Z'+0.0mI/LKCl。
注：緩沖液 Z'+蛋白質組分混合物的終體積應為 25ul, 混合物中 KCl 的終濃度應為 0.1mol/L。例如，若用足跡法分析 5ul 含 0.3mol/L 的蛋白質組分，需加入 10ul 緩沖液 Z'+0.0 ml/LKCl 和 10ul 緩沖液 Z'+0.1mol/LKCl, 以使鹽的終濃度為 0.1mol/LKC1。

4) 將蛋白質組分直畢加于裝有適量適當類型 (0.0moI/LKCl 或 0.1mol/LKC1) 的緩沖液 Z'的 f 反應管中。

5) 每個反應管中加入 25ul 探針 DNA 混合物，輕彈混合樣品，置冰上孵育 15 min。同時，取一份 2.5 mg/ml DNA 酶 I 儲液解凍。

7) 探針 DNA 和蛋白質組分孵育 15 min，臨結束前，用冰預冷的水稀釋 DMA 酶Ⅰ。然后顛倒并溫和震蕩，使之徹底混勻。
注：對于不含蛋白質的陰性對照反應，2ul 1:2000 倍稀釋的 DNA 酶 I 可用于大多數 DNA 探針。而對于持定的 DNA 序列，DNA 酶 I 的最適用量可因序列不同而異，對與不純蛋白質的反應，由于可能存在 DNAIII 抑制劑如肌動蛋白單體，通常需要多加一點 DNA 酶 I。粗制的蛋白質組分需要比正常多 20~100 倍的 DNASI。部分純化的蛋白質組分需要比正常多 3~10 倍的 DMA 酶 I。純的蛋白質組分不需要任何過量的 DNA 酶 I。對每個待分析的蛋白質組分，均必須確定其最適的 DNA 酶 I 稀釋度。

8）從冰上取下一份 DNA 探針和蛋白質組分樣品，室溫放置 1 min。
注；足跡分析時，所有必需的東西自動移液器、溶液、定時器、震蕩器，DNA 酶Ⅰ）均井然有序地擺放在--起是有益的。本操作程序進行得越順當，足跡分析的結果將會越好(且重復性也越好)。

9) 于反應管中加入 50ul 10 mmol/L MgCl2 5 mmol/L CaCl2 溶液（室溫)，輕彈混合。于室溫放置 1 min。

10) 于反應管中加入稀釋的 DNA 酶 I 立刻輕彈混合。室溫孵育 lmin。
注：粗制蛋白質組分中的內源性核酸酶會改變 DNA 酶 I 的消化梯。因此，在對粗提物進行足跡分析時，應包括只含提取物而不加 DNA 酶Ⅰ的對照反應。

11) 加 90ulDNA 酶 I 終止液。震蕩混合。
注：通常，每個周期分析三個（或更多個）樣品，下面的例子敘述了如何同時進行三個樣品的分析。



12)(本步可任選）所有樣品的足跡反應都完成后，加入 10ul2.5 mg/ml 蛋白酶 K, 溫和震蕩混合，室溫放置 5 min。這一步對蛋白質的粗提物很有用，但對純的蛋白質則不是必需的。（本步可任選）

13) 為制備電泳樣品，可加 200ul1:1 酚/氯仿。震蕩混合。離心 5 min。

14) 上層轉移至一新管。加 800ul100% 乙醇。顛倒混合，離心 15 min, 沉淀核酸。

15) 移去上清。加 800ul75% 乙醇。震蕩混合。離心 5 min。

16) 移去上清。用 SpeedVac 旋轉濃縮器干燥沉淀物。

17) 加 9ul 甲酰胺加樣緩沖液，震蕩溶解沉淀物。

18) 煮沸 3 min, 置冰上冷卻。

19) 離心 0.5s, 使溶液沉至管底。震蕩混合。加樣 4ul 于序列分折膠上。
注：為確定蛋白結合位點的位置，可將 DNA 酶 I 的酶切樣品加在鄰接于 Maxam-Gilbert 測序梯（sequencingladder)(由足跡探針制備）的泳道上。