ELISPOT實驗方法步驟詳解

ELISPOT

1.      PBS溶解抗原為30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF膜鋪底的96孔滅菌板過夜；

2.      第二天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培養基100 μl封閉1小時，37 ^oC；

3.      準備脾細胞懸液（用氯化銨去除紅細胞，制備成單個脾淋巴細胞懸液）；

4.      從1 × 10⁶/孔開始，按1:3的稀釋度開始逐孔稀釋做不同濃度梯度，并做3個復孔，37 ^oC靜置培養5小時；

5.      PBS洗3～5次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min；

6.      PBS洗3～5次，鏈親和素標記的堿性磷酸酶孵育30 min；

7.      PBS洗3～5次，用底物BCIP/NBT顯色，顯微鏡下觀察顯色反應，顯色后及時終止反應；

8.      計數每孔中的斑點數目，計算每10⁶個脾細胞中抗體分泌細胞數量。