據2004年數據統計，世界上化合物總數多達4700多萬種；在全部有機化合物中僅有20％左右的樣品適用于GC分析，而HPLC可對80％左右的有機化合物進行分離和分析；HPLC特別適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩定性差的化合物以及生物活性物質的分離和分析并且可以做制備；在醫藥、食品、農業、生命科學、化工、環保等領域都有著廣泛的應用潛力。
HPLC的應用領域
1.在食品研究中的分析應用
食品中的天然成分
碳水化合物；
類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇；
脂肪酸和有機酸；
蛋白、肽、氨基酸；
食品添加劑
酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑；
抗氧化劑、防腐劑；
顏料和染料（色素）；
維生素；
污染物
霉菌（黃曲霉毒素）；
農藥殘留和獸藥殘留；
多環芳烴（PAHS）和亞硝酸；
2.在醫藥研究中分析應用
藥物分析有USP、BP、CP等標準：
常用藥物研究中的應用：解熱鎮痛藥、鎮靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。
甾體藥物研究中的應用：腎上腺皮質激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。
抗菌素類藥物研究中的應用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環素、氯霉素、諾氟沙星等。
中草藥研究中的應用：
生物堿、甙類(皂甙、強心甙、黃酮甙等)、萜類；
手性藥物研究中的應用：
光學異構體的拆分(如，解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構體毒性很強)
醫療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學研究。
在生物化學和生物工程中的應用：
氨基酸、多肽合成和蛋白質的分析研究；
核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究；
生物胺的分析研究（兒茶酚胺類)；
在精細化工分析中的應用：
醇、醛和酮、醚的分離分析；
酸和酯的分離分析；
表面活性劑的分析；
聚合物的分析研究；
藥物、農藥、染料、炸藥等工業產品；
化妝品行業要控制和分析：
防腐劑、防曬劑、性激素以及維生素等；
在公安、刑警破案工作需要：
投毒藥物、毒品分析等；
在環境污染分析中的應用：
廢氣、廢水、廢渣中多環芳烴、多氯聯苯、農藥殘留、酚類和胺類的檢測；
在無機離子分析中應用：
飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析；
方法開發的過程
1.想辦法得到各種信息：
向同行了解是否做過此類樣品或是否有類似樣品的分析方法；
查文獻和方法，如，CA，AA，AOAC，EP；
儀器制造商的文獻，如，Dionex，Waters。
2.對色譜柱有足夠的了解：
掌握分離機理，自己開發方法；
充分了解您自己的樣品；
分析時要了解哪方面的情況？
靈敏度的要求有多高?
樣品的本底是否很復雜?
有多少組份要分析?
對分析的精確度、準確度等有多高要求?
是否因是日常檢驗，而要求方法容易使用?
3.分離(制備)時要了解哪方面的情況？
要分離（即，制備）的樣品量有多大?
要分離的組份在樣品中的含量很高?還是微量?
是否需要保持生物活性?
對分離產物純度的要求有多高?
純度或活性的鑒定如何完成?
4.使用文獻方法注意點。。。
5.色譜柱填料的種類、品牌是否相同?
6.注意文獻方法的流動相；
7.注意色譜柱的規格：內徑、柱長；
需要調整流速與進樣量；
8.注意梯度條件；
9.了解系統的滯后體積（梯度）；
具體操作步驟：
（一）選擇HPLC檢測器：
對樣品有響應并有一個輸出信號；
應該提供在檢測器響應值與樣品濃度之間的線性關系并且所設計的校正技術應該促進這種關系；
但是：
由于受HPLC系統其他部件的影響會產生響應與濃度之間關系的與線性偏離現象；
并不是所有的檢測器是線性的；
受HPLC系統其他部件的影響，檢測器的表現可能與其最佳水平有較大的差距；
（二）用于HPLC的檢測器：
沒有任何一種單獨的檢測器可以適應所有的液相色譜分離！
1.HPLC檢測器可以分為：
溶質性質檢測器（選擇型）：
對溶質的物理或化學性質響應，一般不反應流動相的變化（選擇型）；
整體性質檢測器（通用型）：
不管是否有溶質，對流動相任何物理性質的變化作出響應（通用型）；
2.理想的HPLC檢測器：
高靈敏度；
可忽略的基線噪音；
寬的線性范圍；
獨立于流動相及操作參數的響應；
對壓力、溫度及流速等變化不敏感；
長時間操作的穩定性；
低死體積；
非破壞性；
選擇性；
（三）吸光度（V/Vis）檢測
1.原理：
基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收；
2.定量基礎：
比耳定律：A＝KCL；
①優點：
1）對溫度和流速不敏感；
2）可用于梯度洗脫；
3）靈敏度較高，ng級檢測；
②缺點：
選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質；
3.應用
大多數有機化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數的化合物，是目前實驗室中使用最多的檢測器；多數公司售出的檢測器中75%以上是吸光度檢測器（其中，50%以上是紫外/可見檢測器，25%是PDA）。
一種三維水平的吸光度檢測器——采集三維譜圖；
兼顧紫外檢測器及可見分光光度計的信息：
在收集色譜圖的同時，得到光譜圖；
提供許多有用的功能：
色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認；
可以發現單波長檢測時未測到的峰；
任意波長的色譜再處理；
光譜信息—光譜庫的建立檢索和擬合；
熒光（Fluorescence）檢測原理：
原理：發熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達到激發態，當其返回到基態時發射光的現象，即，熒光；
優點：熒光檢測器靈敏度高，pg級檢測；
缺點：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生；
環境中的污染物
多環芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等。。。
食品、飲料
食品中的毒素；例如，黃曲霉毒素；
染料；
維生素及衍生氨基酸；
生物技術及制藥
四．示差折光（Refractive Index）檢測
示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀六十年代末、七十年代初）
通常被認為是一種通用檢測器；
檢測溶液中所有被溶解的溶質——非特異性；
任何光學介質的折光率都被定義為光在該介質中與真空中的速度之比值
1.原理：
連續測定流通池中溶液折射率來測定試樣；
各組分濃度。
優點：
通用型檢測器
缺點：
1）對溫度變化敏感；
2）不能用于梯度檢測；
3）靈敏度低，μg級檢測；
示差檢測器的應用
示差折光檢測器是通用型檢測器，如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質都可以檢測。
特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物，例如，糖類、醇類、酯類以及脂肪酸等；高分子化合物GPC，GFC分析以及復雜樣品純化。
結論
充分用已知樣品結構確定以哪種方法開始
普通反相？離子抑制？離子對？還是其他；
觀察流動相條件改變時色譜峰的移動
根據變化的方向及大小決定下一步干什么；
改變參數時要合理，每次只改動其中一個變量；
色譜柱的改變影響最大；
梯度洗脫有利于復雜樣品的分離；
開發液相色譜方法的考慮因素
分離度是色譜分離中主要考慮的因素
除分離度之外，在開發色譜方法時，以下幾個因素也都要考慮：
靈敏度、載樣量、分析速度、溶劑損耗、成本、容易使用、色譜柱壽命、效率。
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