ICPMS測定全血中5種微量元素及其參考區間的建立

人體內的微量元素含量處于動態平衡中, 缺乏和過量都會對人體產生不良影響。人體鐵（iron, Fe）、鎂（magnesium, Mg）、鈣（calcium, Ca）、鋅（zinc, Zn）、銅（copper, Cu）元素水平的高低與很多疾病及健康息息相關, 如精神分裂、動脈粥樣硬化、阿茲海默癥、早產風險^[、新生兒健康、弗里德賴希共濟失調、慢性疾病、抗氧化保護等。如何快速、準確地檢測人體微量元素水平, 進而推斷與疾病的相關性成為臨床亟待解決的問題。目前, 檢測微量元素的方法有原子吸收光譜法（atomic absorption spectroscopy, AAS）、電感耦合等離子體原子發射光譜法（inductively coupled plasma atomic emission spectrometry, ICP-AES）、電感耦合等離子體質譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）等。其中ICP-MS以其線性范圍寬、檢測敏感性高、可同時測定多種元素、基質效應低等特點受到普遍關注。我們擬建立ICP-MS同時檢測全血中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5種元素的方法, 探討ICP-MS用于臨床大樣本檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

安捷倫7700x電感耦合等離子體質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）、BY-400C型醫用離心機（北京白洋醫療器械有限公司）、BSA224S-CW型分析天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）、優普超純水儀（成都超純科技有限公司）、快速混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司）、Thermo Scientific可調移液器（美國Thermo公司）等。硝酸（超純級, 蘇州晶瑞化學股份有限公司）、Triton 100（美國西格瑪奧德里奇貿易有限公司）。Fe、Mg、Ca、Zn、Cu標準品（可溯源至中國計量科學研究院）及內標品鍺（germanium, Ge）由國家有色金屬及電子材料分析檢測中心提供, 濃度均為1 000 μ g/mL。1 μ g/L調諧液（鈰、鈷、鋰、Mg、鉈、釔混合液, 美國安捷倫科技有限公司）

1.2 方法

1.2.1 儀器準備 儀器按正常程序開機, 抽真空, 然后在待機情況下進行儀器維護, 點火調諧, 性能驗證成功后進行批處理調諧。相關工作參數：載氣流速為0.35 L/min, 氣流速為0.61 L/min; 等離子體模式, 高基質系統; 等離子體氣流速為15 L/min; 采樣深度為10 mm; 射頻功率為1 550 W; 提取透鏡為-200 V; Omega透鏡電壓為11.0 V; Omega偏轉電壓為-70 V; 積分時間為0.1 s; 重復次數為3次; 蠕動泵流速為0.1 r/min; 氦氣流速為5 L/min。在批處理調諧相關參數達到分析要求[質量軸± 0.1、每秒計數值（counts per second, CPS）> 2 400、氧化物< 1%, 雙電荷< 3%]后開始正常分析程序。

1.2.2 采樣前相關試劑及系統準備 進樣分析前分別對系統中可能引起污染的部件, 如霧化器、霧化池、炬管及錐進行浸泡清洗, 更換管線, 每個樣本采集結束后分別切換至進樣口沖洗、稀硝酸溶液及超純水清洗, 相關試劑均用超純水稀釋至對應濃度后進樣檢測, 考察各個元素的干擾情況。每個批次分析前分別進樣超純水及稀釋液, 排除空白干擾之后再進行樣本分析。

1.2.3 稀釋液配制 分別移取2.5 mL硝酸及0.5 mL Triton 100至500 mL容量瓶中, 用超純水定容至刻度, 然后轉移至聚丙稀瓶中, 得到含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀釋液, 儲存于4 ℃冰箱中待用。

1.2.4 標準應用液配制 分別移取不同體積的標準品母液, 參照全血樣本中不同目標元素水平進行配制, 分別得到混合標準品母液, 其中Fe、Mg、Ca、Zn、Cu水平分別為500、50、125、12.5、3.125 μ g/mL。同樣移取適量內標品配制得到0.5 μ g/mL 內標液, 然后分別移取2.5、5、10、20、40 μ L母液, 加入20 μ L內標液, 然后分別定容至1 mL, 得到S1、S2、S3、S4、S5 5個濃度, 待用。

1.2.5 樣本稀釋準備 將全血樣本充分混勻, 然后準確移取20 μ L全血樣本, 加入20 μ L內標液, 再加入960 μ L含0.5%硝酸、0.1%Triton 100的稀釋液, 定容至1 mL, 充分混勻, 采用蠕動泵連續進樣, 采集時間為0.1 s。

1.3 方法學評價

1.3.1 線性評價 將混合標準應用液S1~S5按正常程序進行處理并進樣分析, 觀察Fe、Mg、Ca、Zn、Cu 5種元素標準曲線的線性。

1.3.2 基質效應及相關干擾 分別準備2個水平的混合標準品（C1）, C1為理論濃度, 進樣分析得到一個檢測值C2。將同樣水平的標準品加入全血樣本中, 檢測得到加入量C3, 分別進樣。平行檢測6份樣本, 計算C1、C2與C3的相對標準偏差, 即目標元素在純稀釋液中與在全血基質中結果的差異, 評價基質干擾程度。每批標準應用液檢測結束之后進樣分析空白稀釋液, 如果采集記數超過最低點計數的20%則繼續進行空白稀釋液分析, 直至殘留干擾達到S1點的20%以內。

1.3.3 精密度 分別準備低、中、高水平混合全血樣本, 進行6次重復處理后進樣分析, 檢測5種元素的水平, 觀察批內重復性[以變異系數（coefficient of variation, CV）表示]; 準備低、中、高水平全血樣本, 分3批進行6次重復處理（分3 d, 每天2批）, 進樣分析, 檢測5種元素的水平, 觀察批間重復性（以CV表示）。

1.3.4 添加回收試驗 將1份混合全血樣本平行測定20次, 求得本底值L1, 在此基礎上添加中水平和高水平標準品得到L2和L3, 然后分別檢測L2和L3各元素的水平及對應的添加回收率。

1.3.5 室間比對試驗 分別準備3個不同水平的全血樣本（C1、C2、C3）, 每個水平進行6次進樣檢測, 將本實驗室的測定結果與安捷倫科技（中國）有限公司上海分公司實驗室（簡稱安捷倫實驗室）的安捷倫7700x電感耦合等離子體質譜儀的測定結果進行比對, 觀察不同實驗室間結果的差異。

1.3.6 參考區間的建立 選取2016年7月杭州地區體檢正常者495名, 其中男242名、女253名, 年齡2~50歲。按年齡分為≤ 16歲組（254名）和> 16歲組（241名）。采用肝素鈉抗凝真空采血管采集靜脈全血樣本, 充分搖勻, 2~8 ℃保存待測, 采用ICP-MS檢測5種元素, 建立正常人群的參考區間。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。正態性檢驗結果顯示所有數據均呈正態分布, 以x± s表示, 組間比較采用t檢驗, 以x± 2s方式建立參考區間。以P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 線性評價及最低定量限（limit of quantitation, LOQ）

以標準點濃度為X, 對應元素CPS與內標CPS比率為Y, 建立線性回歸方程, r值為0.999 6~1.000 0。5種元素線性均良好。見表1。

表1 5種元素線性回歸方程及線性范圍

重復檢測超純水11次, 計算標準偏差, 以10倍標準偏差作為該法的LOQ, 見表1。

2.2 基質效應

相對標準偏差范圍為0.7%~6.0%, 稀釋之后基質對檢測結果基本無影響。見表2。

表2 5種元素基質效應分析

2.3 精密度驗證

采用ICP-MS檢測低、中、高水平樣本, Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的批內CV為0.31%~3.62%, 批間CV為1.37%~7.15%。見表3。

表3 5種元素批內、批間CV結果 （%）

2.4 添加回收試驗

將L2、L3處理后分別檢測6次, 求得L2、L3均值, Fe、Mg、Ca、Zn、Cu對應的添加回收率為98.2%~112.7%, 符合要求（100%± 20%）。見表4。

表4 添加回收試驗結果

2.5 室間比對分析

本實驗室測定結果與安捷倫實驗室的平均相對偏差為0.61%~5.56%, 本方法準確度滿足要求, 可用于大樣本分析。見表5。

表5 室間比對分析結果

2.6 臨床應用及參考區間統計

男、女性之間5種元素差異均無統計學意義（P> 0.05）。按年齡劃分為未成年組（≤ 16歲）和成年組（> 16歲）, 成年組與未成年組比較差異均有統計學意義（P< 0.05）。未成年組Cu元素比成年組低1.0%, Ca元素比成年組高8.5%, Mg元素比成年組高4.3%, Fe元素比成人組低2.4%, Zn元素比成年組低24.4%。以x± 2s計算參考區間。見表6、表7。

表6 成年組與未成年組Mg、Ca、Fe、Cu 、Zn結果的比較 （mg/L, x± s）

表7 Mg、Ca、Fe、Cu、Zn的參考區間 （mg/L）

3 討論

隨著人們對營養要求關注的增加, 各種食品中或多或少會添加單一元素或復合元素, 以補充人體所需的微量元素。本研究結果顯示, 未成年人Zn水平相對較低, 與文獻報道一致, 因此需引起臨床重視, 但也不可盲目補充, 應結合相應檢測結果適當地進行控制或補充。

ICP-MS是20世紀80年代發展起來的較新的檢測技術, 其將ICP的高溫電離特性與四極桿質譜的高敏感性相結合, 形成一種新型的同位素分析、元素分析和形態分析技術, 具有檢出線性范圍寬、檢出限低、干擾因素少、基質效應低、分析精密度高、分析速度快等特性, 廣泛應用于環境、化工、食品、醫學等多個領域。本研究結果顯示, ICP-MS檢測全血Fe、Mg、Ca、Zn、Cu的線性關系良好, 批內、批間精密度均符合臨床檢測要求, 同時還初步建立了杭州地區未成年人與成年人全血5種元素的參考區間。

綜上所述, ICP-MS具有敏感性高、抗干擾能力強、準確度高及穩定性好的優點, 可同時檢測Fe、Mg、Ca、Zn、Cu元素, 而且臨床適用性較好, 可為臨床相關疾病的診斷提供參考依據。