M13噬菌體液體培養

M13 噬菌斑 大腸桿菌 F' 菌株

LB 瓊脂平扳 M9 基本培養基平板 LB 或 YT 培養基 無菌牙簽或接種針或玻璃毛細管

一、材料

1. 培養基

含四環素或卡那霉素的 LB 培養基 或 加富 M9 基本培養基

LB 或 YT 培養基

含 5 mmol/L MgCl₂ 的 2 X YT 培養基

2. 專用設備

無菌牙簽或接種針或玻璃毛細管（50 μl )

3. 載體和菌株

鋪于瓊脂或瓊脂糖平板上的 M13 噬菌斑（制備上層瓊脂或瓊脂糖中的噬菌斑的方法）

大腸桿菌 F' 菌株，生長于瓊脂平板上，克隆分離良好。（取適當菌株的主培養物在 M9 基本瓊脂平板上劃線，對抗生素抗性菌株，則在含適當抗生素的 LB 平板上劃線，37℃ 培養 24~36 h。M13 噬菌體的單鏈 DNA 如果是用于作為寡核苷酸介導的突變則其應在含 dut 和 ung 基因突變的大腸桿菌中增殖。）

二、方法

1. 取帶有 F' 質粒的大腸桿菌的一個新長成的單菌落接種 5 ml 加富培養基（對抗生素抗性菌株則用含適當抗生素的 LB 培養基），37℃ 溫和振蕩 12 h。

2. 取 0.1 ml 培養物接種 5 ml 含 5 mmol/L MgCl₂ 的 2 X YT 培養基，37℃ 劇烈振蕩培養 2 h。

3. 將 5 ml 培養物用 45 ml 含 5 mmol/L MgCl₂ 的 2 X YT 培養基稀釋，每支 1 ml 分裝無菌試管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm), 按需增殖的噬菌斑的數量確定試管數，另再分裝 2 支作為噬菌體生長的陰性和陽性對照。將這些試管放于一邊，步驟 7 使用。

4. 每支 1 ml YT 或 LB 分裝無菌試管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm), 按需增殖的噬菌斑的數量確定試管數，另再分裝 2 支作為噬菌體生長的陰性和陽性對照。

5. 用無菌接種針蘸取噬菌斑表面，在 YT 或 LB培養基中漂洗，制備 M13 噬菌體稀釋懸液。挑取一個藍色噬菌斑作為噬菌體生長的陽性對照，在平板上挑取一處無噬菌斑的大腸桿菌層，作為陰性對照。

6. 懸液室溫放置 1~2 h, 使噬菌體顆粒從瓊脂中擴散出來。

7. 取 0.1 ml 噬菌體懸液（步驟 6) 感染 1 ml 大腸桿菌培養物（步驟 3) 用于分離病毒 DNA。37℃ 溫和振蕩培養 5 h。



8. 培養液轉到一個無菌微量離心管中，最大轉速室溫離心 5 min, 不要攪動細菌沉淀， 上清轉移至一個新的微量離心管中。

9. 取 0.1 ml 上清置于一個無菌微量離心管中。

10. 剩余的 1 ml 培養上清制備噬菌體單鏈 DNA。細菌沉淀用于制備雙鏈 RF DNA。