Nature|介導X染色體失活關鍵調控因子

　　X染色體失活（X-chromosome inactivation）現象指的是在雌性哺乳動物中有一條X染色體被隨機沉默，是在1961年由Mary Lyon發現的【1】，因此該現象又被稱為里昂化（Lyonization）。X染色體失活現象發現到現在約60年的時間里，關于該現象的研究已有數千篇，但其中的機制仍有不甚明朗之處。

　　2020年2月6日，德國海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Edith Heard研究組在Nature發文題為SPEN integrates transcriptional and epigenetic control of X-inactivation，發現SPEN對于胚胎植入前的小鼠胚胎以及胚胎干細胞中X染色體中基因沉默起始非常關鍵，揭開了SPEN調控X染色體失活的具體分子機制。

　　Xist是調控X染色體失活的重要lncRNA（Long non-coding RNA），前人通過多種系統性相互作用組的方式發現了與Xist相互作用的蛋白【2-4】。其中SPEN（一種轉錄抑制因子）通過與Xist中A-repeat結構域相互作用而促進基因沉默【2】。但是SPEN的具體作用機制并不清楚。為了對SPEN的在X染色體失活中的作用，作者們使用生長素誘導的降解子（Auxin-inducible degron, AID）系統控制體內SPEN蛋白的降解（圖1）【5】。使用AID系統，在對小鼠胚胎干細胞進行生長素處理的1小時后SPEN蛋白質水平顯著降低，而移除生長素后SPEN的蛋白質水平又可以快速恢復回來，說明AID依賴的SPEN蛋白質控制非常靈敏且有效。

圖1 通過AID系統內源降解SPEN蛋白

　　在此基礎上，作者們在誘導Xist表達并清除SPEN之后進行了RNA-seq。作者們發現與前人的結果相一致的是，SPEN的敲除并不會影響Xist的定位【3】。然而，在沒有SPEN的情況下，整個X染色體上的基因沉默幾乎完全消失。382個X連鎖的基因中大約有80%完全依賴于SPEN調控的基因沉默。進一步地，作者們對小鼠早期胚胎發育過程進行研究后發現早期X染色體失活以及基因沉默同樣也依賴于SPEN。

　　那么，SPEN是在什么時候被Xist招募到染色體上的呢？作者們通過HaloTag標記【6】與RNA FISH聯用的方式發現SPEN在X染色體失活過程中Xist開始覆蓋在X染色體上的時候就會被招募過來。通過染色體結構捕獲技術科學家們發現，失活的X染色體會被折疊形成巨大結構域（Megadomain），除了逃逸基因之外其他拓撲結構域（Topologically associating domains, TADs）全部消失【7】。Xist RNA之前被發現與失活的X染色體結構相關【4】。但是作者們發現，在敲除SPEN之后，失活的X染色體的結構沒有明顯的變化。

　　為了確認SPEN在X染色體過程中是如何發揮作用的，作者們對SPEN包含的不同結構域進行了短截片段的分析。SPEN是一個非常大的蛋白（大約400kDa），包含四個RNA識別結構域(RRM)，一個細胞核受體互作結構域（Nuclear receptor interaction domain, RID）以及一個SPOC(SPEN paralogue/orthologue C-terminal)結構域。其中RRM2-4對于SPEN的招募以及基因沉默非常關鍵，這與前人在體外進行的實驗結果是一致的【8】。而SPOC的敲除雖然對于SPEN的招募被沒有什么影響，但是卻顯著影響X染色體失活。這說明，SPOC對于X染色體失活過程非常關鍵。作者們通過研究發現，SPOC結構域是SPEN和Xist與轉錄調控以及染色質調節多種因子相互作用的橋梁，他們一起作用調節X染色體失活過程中的基因沉默。而SPEN的積累伴隨著Xist在X染色體上的延伸，SPEN傾向于在結合在X染色體上活躍表達的基因，說明SPEN能夠依賴于轉錄活性靶向染色質上的靶點基因。而且，這些靶點都是受到SPEN調控基因沉默的基因。另外，作者們發現SPEN結合峰與RNAPII磷酸化S5位點大量重合，S5位點與轉錄起始相關。這些結果表明，SPEN發揮作用的機制是通過在啟動子和增強子區域的調節來促進基因沉默的。

　　總的來說，Edith Heard研究組的工作發現RNA介導招募的SPEN是X染色體失活過程中的重要調控因子。SPEN通過將轉錄機器以及其他例如組蛋白去乙酰化酶以及染色體重塑因子等調控信號通路與Xist之間相互聯系，確保了穩健而有效的X染色體失活。

圖2 Xist招募SPEN聯結轉錄機器、組蛋白去乙酰化酶以及染色體重塑因子等確保X染色體失活過程的模式圖

　　參考文獻

　　1. Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.). Nature 190, 372-373, doi:10.1038/190372a0 (1961).

　　2. Chu, C. et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell 161, 404-416, doi:10.1016/j.cell.2015.03.025 (2015).

　　3. McHugh, C. A. et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature 521, 232-236, doi:10.1038/nature14443 (2015).

　　4. Minajigi, A. et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science 349, doi:10.1126/science.aab2276 aab227610.1126/science.aab2276 (2015).

　　5 Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T. & Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat Methods 6, 917-922, doi:10.1038/nmeth.1401 (2009).

　　6 Grimm, J. B. et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods 12, 244-250, 243 p following 250, doi:10.1038/nmeth.3256 (2015).

　　7 Giorgetti, L. et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse. Nature 535, 575-579, doi:10.1038/nature18589 (2016).

　　8 Lu, Z. et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell 165, 1267-1279, doi:10.1016/j.cell.2016.04.028 (2016).