2、循環中的變性步驟
循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3、引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。
退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4、引物延伸
引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略 延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。
5、循環數
大多數PCR含25-40循環，過多易產生非特異擴增。
6、最后延伸
在最后一個循環后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。