PCR技術PCR技術的應用

一滴殘留在裙子上的精液使得美國總統Bill Clinton不得不坦承他與白宮實習生有不正當的關系。因為他知道現在的生物科技就連一個精子也能被用來做為證據。這種將極微量的生物標本化為可供鑒定的現代技術正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶鏈式反應具有的特色之一。這也是分子生物醫學令人震撼的一例。 

何謂PCR 
    簡單的說，PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制.目前常用的技術,可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。 

PCR的要素
     基本的PCR須具備１.要被復制的DNA模板 (Template) ２.界定復制范圍兩端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。PCR的反應包括三個主要步驟，分別是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱變性， 將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以做為復制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。 最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq-polymerase) 的作用下進行引物的延長 (Extension of primers)及另一股的合成。

PCR 的問題，無疑是絕大多數學生物的人都關心的問題。今天我們把相關內容整理出來，與大家共同討論，希望對大家能有所幫助。 一、引物設計所謂“工欲善其事，必先利其器”，這年頭手工設計引物的人似乎不多，還是用軟件方便些，防止你一不小心看走眼，丟一個堿基，同時計算起來也方便。設計軟件有很多，既可以在線設計（如Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi），也可以用Primer5、Oligo6.65 等等。1. 引物設計的原則細心地進行引物設計是PCR 中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同時擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：1）典型的引物18 到24 個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。2）選擇GC 含量為40％到60％或GC 含量與模板GC 含量接近的引物。3）設計5'端和中間區為G 或C 的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。4）避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。在用軟件設計時大家常常會疑惑,究竟? G 不能低于多少?這里有個數據: ? G 為0~-2時,PCR 產率可達100%, ? G=-6 時,為40%.5）避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5 個核苷中含有3 個A 或T。6）避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。3’最好以G或C 結尾，防止AT 的松散結合引起錯配。7）避免存在可能會產生內部二級結構如發夾結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。8）引物的一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA 分子時的溫度。兩引物的Tm 值相差不應大于5℃。計算Tm 有幾種公式。第一個公式(Wallace 規則):Tm = 4℃（g + C） +2℃（a + T）,這來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于15-20個堿基的引物,也適用于手工設計時的簡單計算。第二個公式(Baldino 算法)適用于計算14-70個核苷酸在≤0.4mol\L 的陽離子溶液中的Tm, 也可用于擴增產物的Tm 計算.Tm=81.5+16.6*lg[K⁺]+0.41(%[G+C])-(675/n)。以上兩種算法都是基于堿基組成而不是堿基排列而計算的，事實上相同堿基組成的引物Tm 可能差異不小：GGGAA 和GAGAG 的Tm 是不一樣的，所以確定引物Tm 最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序如Primer5 等均使用近鄰分析法。9）當在引物5’端添加酶切位點時要考慮：a)該目的序列內部不得含有相同的酶切位點，在引物發出后才發現錯誤的事情本人就干過，在論壇上也能看到這樣的粗心人。這樣的錯誤會給將來的克隆造成麻煩。b)如果打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位點的外側再加上保護堿基，不同的酶對于保護堿基的要求是不同的。如果不設計保護堿基，則多半要用TA 克隆的方式連接到質粒上，這時要注意Taq 酶的選擇，這一點在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm 值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。10）有時候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。特別要注意的是：不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端最后3 個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM 到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。說了半天了,想起來還得提醒大家一句:千萬別搞錯了引物的位置！這句話似乎多余。看了上面的圖吧,如果要擴增目的序列為“ATG…………TGA”的片段，則引物分別為“ATG……”和“TCA……”仔細琢磨一下，特別是5’端再接上酶切位點可別搞錯了！合成錯了一條可就是50 塊錢，到時候挨老板批的時候別怪我沒提醒你哦：）設計好了引物就要讓公司合成，這時候別忘了談價格：）現在競爭很厲害，價格已經挺便宜了，注意兩個參數：一個是OD 值，如果公司說1OD 能比2OD 優惠，那通常1OD 足夠了。第二是純度，是HPLC 的還是OPC 的，事先要說好，建議看看這里（唉，不是我給他們做廣告，只是他們的說明書寫得真不錯）：http://www.takara.com.cn/product/cs/c_3.htm#1引物設計方面還有很多話題可說，比如如何利用引物搭橋將兩個片段通過PCR 而不是酶連接起來、如果要設計引物表達蛋白時注意“N 端規則”。 二、PCR 成分引用《分子克隆3》提供的PCR 標準反應條件：模板1pg-1μg引物1μmol/LDNA 聚合酶1－5 單位Mg^2＋ 1.5mmol/LdNTPs 200μmol/LKCl 50 mmol/L1. 模板模板可是PCR 的關鍵，模板的質量是PCR 成功的先決條件，巧婦難為無米之炊嘛！怎樣得到模板，這可是一個大問題，僅僅一個提取基因組DNA 就有很多的名堂，這會是我們后面專輯的內容，這里不多說啦，有問題來論壇討論吧。P 不出東西的時候不妨先考慮：模板有沒有問題？（DNA 樣品中發現有多種污染物會抑制PCR。一些在標準基因組DNA 制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會抑制擴增反應。）所需的最佳模板量取決于基因組的大小。你的目的片段在基因組中占多少？至少要保證模板中含有一個單拷貝吧！100ng 到1μg 的人類基因組DNA，相當于3×104 到3×105 個分子。所以對于單拷貝基因,這需要0.1μg 的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng 的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,用量更少.靈敏的PCR 可從一個細胞,一根頭發,一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產物.DNA中的雜質也會影響PCR的效率。2. 引物引物以干粉形式運輸。最好用TE 重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE 比去離子水好，因為水的pH 經常偏酸，會引起寡核苷的水解。當然，如果擔心TE 對于PCR 的影響，不妨用ddH2O。引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM 濃度溶于TE 的引物在-20℃可以穩定保存6 個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1 周。干粉引物可以在-20℃保存至少1 年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2 個月。注意：溶解之前先離心一下，防止一開蓋就飛了。引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1 到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。通常跟著引物來的說明書會告訴你，關于寡核苷酸的計算可以看看這里：http://www.takara.com.cn/product/fl/i_1.htm3. 聚合酶的選擇這可是有講究，咱論壇里有個專題討論這個問題。主要考慮兩個方面：用途——對保真度的要求高不高？成本——高保真的酶總是會貴一些的。綜合考慮一下找個平衡點吧，當然啦，該花錢的時候可不能省。Taq DNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因為其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用帶有3'到5'外切核酸酶活性的熱穩定聚合酶可以提高保真度。但是這些聚合酶的產量比Taq DNA聚合酶低。在很多公司的手冊中有對各種酶特性的描述，大家不妨比較一下。提醒一點：高保真酶除了我所知的Merck的Easy-A 以外，都不會在3’端加A尾巴（因為其3’-5’外切酶活性），所以做TA克隆的時候需要一點小訣竅——擴增完了再加普通Taq去加個A。另外還有個方法：將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的保真度，并可以得到高產量及擴增長模板。4. Mg2＋濃度鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始濃度是1.5mM（注意：對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液）。在多數情況下，較高的游離鎂離子濃度可以增加產量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性（當然，也有相反的報道）。為了確定最佳濃度, 可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗,選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,以保證最適Mg2+ 濃度。5. dNTPs高濃度的dNTPs會對擴增反應起抑制作用。將每種dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以使擴增產物獲得滿意的產率。6. KCl標準濃度為50 mmol/L, 對于較短片段可將其提高到70-100 mmol/L. 三、PCR 反應參數1. 變性：在第一輪循環前,在94℃下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR 失敗,因為未變性完全的DNA 雙鏈會很快復性,減少DNA 產量.一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC 的序列,可適當提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。2. 退火：這是PCR 的一個關鍵參數。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm 低5℃, 當產物中包含有影響實驗的非可異性擴增帶時,以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。如果兩個引物Tm 不同，將退火溫度設定為比最低的Tm 低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm 設計的退火溫度先進行5 個循環，然后在根據較低Tm 設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環, 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。3. 延伸：延伸反應通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應溫度75℃.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產物, 這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。4. 循環次數： 當其它參數確定之后, 循環次數主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多,會使PCR 產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30 輪循環擴增后, 反應中Taq DNA 聚合酶已經不足, 如果此時產物量仍不夠, 需要進一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋10³-10⁵倍作為模板, 重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經60 輪循環后, 擴增水平可達10⁹-10¹⁰。擴增產物的量還與擴增效率有關,擴增產物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)ⁿ 。其中：C 為擴增產物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環次數。在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應，減少非特異性產物。 四、提高PCR 擴增特異性1. 遞減PCR（TouchDown PCR）遞減PCR 通過在PCR 的前幾個循環使用嚴緊的退火條件提高特異性。循環設在比估算的Tm 高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環降低1℃到2℃（當然，也可以每幾個循環降1－2℃），直到退火溫度低于Tm 5℃。特異性最高的目的模板會被優先擴增，這些產物在隨后的循環中繼續擴增占據優勢。遞減PCR 對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP? DNA 指紋分析。2. 熱啟動熱啟動PCR 是除了好的引物設計之外，提高PCR 特異性最重要的方法之一。盡管TaqDNA 聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR 反應配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如定點突變、表達克隆或用于DNA 工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR 尤為有效。并且，熱啟動在很大程度上防止引物二聚的發生。限制Taq DNA 聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 反應液，并將其置于預熱的PCR 儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA 合成，直到PCR 儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA 聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。3. 促進PCR 的添加劑退火溫度，引物設計和鎂離子濃度的優化足以對大多數模板進行高特異性的擴增，但是，某些模板，包括高GC 含量的模板，需要其他的措施。影響DNA 熔解溫度的添加劑提供了提高產物特異性和產量的另外一種方法。為獲得最好的結果需要模板的完全變性。另外，二級結構會阻止引物結合和酶的延伸。PCR 添加劑，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿以及PCRx Enhancer Solution 可以增強擴增。它們可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA 聚合酶延伸通過二級結構區。PCRx Solution 還有其他優點。在同PlatinumTaq DNA 聚合酶和Platinum Pfx DNA 聚合酶一起使用時，僅需很少的鎂離子優化。這樣，將Platinum 技術同添加劑結合，增強了特異性，同時減少了第三種方法-鎂離子優化的依賴。為獲得最佳結果，應優化添加劑的濃度，尤其是會抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。4. 巢式PCR使用巢式引物進行連續多輪擴增可以提高特異性和靈敏度。第一輪是15 到20 個循環的標準擴增。將一小部分起始擴增產物稀釋100 到1000 倍加入到第二輪擴增中進行15 到20個循環。或者，也可以通過凝膠純化將起始擴增產物進行大小選擇。在第二輪擴增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物內側的靶序列結合。巢式PCR 的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同兩套引物都互補的靶序列很少。而使用同樣的引物對進行總數相同的循環（30 到40）會擴增非特異性靶位點。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE）的特異性。 五、PCR 產物測序對于PCR 產物的測序有兩個方式:1. DNA 直接測序: 指直接分析不經分離的PCR 擴增產物,如果各個位點上堿基序列都是一致的,則所得信號是確定的,否則,在那些有相異堿基的位點出現模糊信號, 如果模板在多數情況下被正確擴增,則少數的突變將被掩蓋,這是結果顯示的是模板的序列.但是,當擴增的前幾輪即出現錯誤擴增并被后續的循環積累,這時就不再反映模板的狀況.2. PCR 產物經克隆后測序: 這是對單克隆測序,其結果是反映單一擴增產物的序列,結果是確定的. 六、PCR 污染與對策PCR 反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生.1、污染原因(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染.(二)PCR 試劑的污染:主要是由于在PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染.(三)PCR 擴增產物污染.這是PCR 反應中最主要最常見的污染問題.因為PCR 產物拷貝量大(一般為1013 拷貝/ml)，遠遠高于PCR 檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR 產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性.還有一種容易忽視，最可能造成PCR 產物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四)實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大.2、污染的監測一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染.對照試驗：1）陽性對照:在建立PCR 反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR 陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志.陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100 個拷貝以下).但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR 試劑經自己使用穩定，檢驗人員心中有數時，在以后的實驗中可免設陽性對照.2）陰性對照:每次PCR 實驗務必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照.②試劑對照:在PCR 試劑中不加模板DNA 或RNA，進行PCR 擴增，以監測試劑是否污染.3）重復性試驗4）選擇不同區域的引物進行PCR 擴增

3、防止污染的方法(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR 反應液、PCR 循環擴增及PCR 產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意樣本處理及PCR 產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開.最好能劃分①標本處理區;②PCR 反應液制備區;③PCR 循環擴增區;④PCR 產物鑒定區. 其實驗用品及吸樣槍應專用.實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA 或RNA.(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染.(三)預混和分裝PCR 試劑:所有的PCR 試劑都應小量分裝，如有可能，PCR 反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存.以減少重復加樣次數，避免污染機會.另外，PCR 試劑，PCR 反應液應與樣品及PCR 產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱.(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.(五)設立適當的陽性對照和陰性對照，陽性對照以能出現擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照.(六)減少PCR 循環次數，只要PCR 產物達到檢測水平就適可而止.(七)選擇質量好的Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要輕，以防管內液體濺出.4、PCR 污染解決對策（這是從另一篇文章總結而來，與前面的部分略有重復，大家隨便看看吧）PCR 檢測微量感染因子時，一定要注意產物殘留污染的問題。 一． 污染的預防進行PCR 操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR 污染或杜絕污染的出現。（一）劃分操作區：目前，普通PCR 尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：1. 標本處理區，包括擴增摸板的制備；2. PCR 擴增區，包括反應液的配制和PCR 擴增；3. 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增? 產物分析? 產物處理。切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。（二）分裝試劑：PCR 擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA 和其他來源的DNA：1．PCR 用水應為高壓的雙蒸水；2．引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無PCR 擴增產物區配制；3．引物和dNTP 應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。(三) 實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR 產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR 反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR 產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；8. 重復實驗，驗證結果，慎下結論。 二． 追蹤污染源如果不慎發生污染情況，應從下面幾條出發，逐一分析，排除污染。（一）設立陰陽性對照：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質粒為對照，100 個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR 體系中各試劑的時機對照，即包括PCR 反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR 產物殘留污染是非常有益的。如果擴增結果中試劑對照為陽性結果，就是某一種或數種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。（二）環境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發現試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。環境污染中常見的污染源主要有：1. 模板提取時真空抽干裝置；2. 凝膠電泳加樣器；3. 電泳裝置；4. 紫外分析儀；5. 切膠用刀或手術刀片；6. 離心機；7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等；此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml 去離子水浸泡；3）取5ml 做PCR 實驗；4）電泳檢測結果。8. 氣溶膠。如果經過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產物的氣溶膠造成的，此時就應該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。 三．污染處理（一）環境污染1. 稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA 脫嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產物污染時，要考慮PCR 產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV 照射僅對500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。UV 照射時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰核苷酸的序列。在受照射的長DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內的交聯和DNA 斷裂等）均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。如果這些位點（ 0.13/堿基）在DNA 分子上隨機分布，一個500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點，那么，10⁵個這樣的分子中每個分子中會至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，10⁵個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長度限制的原因。 （二）反應液污染可采用下列方法之一處理：1. DNase I 法：PCR 混合液（未加模板和Taq 聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30min 后加熱滅活，然后加入模板和Taq 聚合酶進行正常PCR 擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA 的序列；2. 內切酶法：選擇識別4 個堿基的內切酶（如Msp I 和Taq I 等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進行PCR；3. 紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進行紫外照射，注意事項與方法同上述UV 照射法；4. g 射線輻射法：1.5kGy 的輻射可完全破壞0.1ng 基因組DNA，2.0 kGy 可破壞104 拷貝的質粒分子，4.0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限度會使PCR 擴增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA 的。 （三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV 照射的去污染作用對500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預防作用日益受到重視和肯定。1. 原理：在PCR 產物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。2. dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR 擴增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU 的新的PCR 產物。3. dU 引物法：合成引物時以dU 代dT，這樣PCR 產物中僅5ˊ端帶dU。UNG 處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb 以上）的擴增用dUTP 法效率較用dTTP低，而用dU 法就可克服這一缺點。dU 引物最好將dU 設計在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。4. 優點：可以去除任何來源的污染；UNG 處理可以和PCR 擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU 存在，可徹底消除污染源。5. 需注意的是摻入dUTP 的DNA