PCR測序方法你知道幾種？（二）

(2)測序引物同位素標記測序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5末端進行同位素標記。引物濃度:0.1~0.2mmol/L

非同位素標記測序引物:用熒光標記4種雙脫氧核苷酸,可以進行以熒光為基礎的雙脫氧測序反應。

(3)DNA聚合酶應為無3→5外切活性的耐熱DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。

(4)測序反應緩沖液根據所用的聚合酶具體而定。

(5)放射性標記的dNTP根據所用的聚合酶具體而定

三、方法

(本操作方法是以同位素標記為基礎的測序)

(1)標記引物取10~15pmol測序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶緩沖液(商品廠家提供),加水至反應體系50,混勻后37℃預熱5min

加人1μ現稀釋的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃繼續孵育30min。

通過凝膠過濾柱除去未摻入的[yP]ATP

標記好的引物可在-70℃保存2周以上。

(2)制備dNTP/ ddNTP混合物在4個微量離心管中各加入一種dNTP/ ddNTP混合物2ul

(3)制備反應混合物取相應的DNA模板、標記的測序引物1~2pmol、3pl的10×測序反應緩沖液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至總體積20l,混勻。在該混合物中加入某些試劑,如DMSO、 Triton X-100、吐溫20或NP40等,徹底混合均勻,可以提高序列梯度的質量。

(4)循環反應分別取反應混合物4團l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的熱循環儀上進行循環反應。每次循環包括:94℃變性1min、40~60℃退火30s和72℃鏈延伸終止30s。循環次數:20~40次。

(5)終止反應體系循環結束后,在各管中加入4pl終止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),混勻。樣品可在一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min

(6)電泳分離和序列判讀每一泳道上樣2~3pl,電泳。采用放射自顯影方法進行序列判讀標記的需要過夜曝光顯影,若用P標記的需要2~3d曝光顯影。

四、注意事項

①在標記引物過程中,為獲得高比活的標記引物,反應體系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一個最佳水平

②確定最佳dNTP/dNTP比例非常關鍵,應采用產生低本底、高顯影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。

③為了提高靠近引物(1~100個堿基范圍內)的序列梯度的自顯影強度,可以向測序反應體系中加人Mn2,提高DNA聚合酶對摻入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而當為了提高遠離引物(200~400個堿基范圍內)的序列梯帶的自顯影強度,則需要提高鏈延伸終止反應混合液中dNTP的含量,具體依所用聚合酶而定。

全自動DNA測序法 

隨著科學技術的發展,DNA測序已從人工操作發展到用自動測序儀進行全自動測序,使得測序的準確度、樣品序列判讀長度和速度有了極大的提高。如今科研工作者只需準備好所需測序的樣品,送至專業的測序公司用全自動DNA測序儀(如 Applied biosystems的377型全自動DNA測序儀)進行測序即可。本節簡單介紹全自動DNA測序儀的特點,不對全自動測序儀的具體操作步驟和注意事項等做詳細介紹。

全自動測序儀一般由:電泳系統,激光檢測裝置,軟件,計算機和打印機等幾部分組成。

全自動測序儀采用4種熒光染料標記核苷酸、在一個泳道測序的方法,有效地避免了因單一標記方法(如同位素標記)中4個泳道電泳時所造成的遷移率不同對測序準確度的影響。

由于可以采用兩種熒光標記方法(標記dNTP法和標記引物5端法)、多種DNA聚合酶和測序試劑盒,使得測序DNA模板種類大大增加,如單鏈DNA、雙鏈DNA和PCR產物等。

全自動測序儀可以采用激光激發,使得代表不同堿基信息的不同顏色熒光先經過光柵分光,經CCD攝像機同步成像,一次掃描可以檢出多種熒光,使得測序速度高達200bp/h,一個樣品一次可以測定700余個堿基。

在電泳技術方面,簡化了灌膠技術,采用精確控溫,提高了測序的精確度

應用多種軟件,可以進行DNA片段大小和定量分析、遺傳基因的組型分析、DNA亞克隆序列拼接、DNA和蛋白質序列比較等。

全自動測序儀可以使得一次測序樣品數量大大增加,多達96個樣品,極大地提高了工作效率。現在國內有許多公司進行全自動測序,只需要將克隆的菌株交給公司,一般在3~5d后即可得到結果,測序的長度在每個反應500~800bp左右。

應用 

PCR測序是對生物遺傳信息的最終判定。隨著各種基因組計劃的開展,PCR測序工作在不斷加強和完善,特別是全自動DNA測序儀的開發,為提前完成人類基因組計劃奠定了基礎。此外,在臨床遺傳病、傳染性疾病和癌癥的基因診斷、農業畜牧業的動植物育種、法醫鑒定等領域上有廣泛的應用前景。過去由于全自動DNA測序的儀器成本較高,手工的同位素標記的測序在國內曾經發揮過重要作用;但隨著國內科研試驗條件的改變,全自動DNA測序儀已在國內廣泛應用于序列的測定,但全自動DNA測序儀廣泛應用于突變的檢測目前還受國內實驗條件的限制。