| 實驗方法原理 | 葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最后流出柱外，將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | 試管試管架燒杯玻璃攪棒移液管滴管試劑瓶層析柱pH計恒流泵梯度混合儀核酸蛋白監測儀GL-20C高速冷凍離心機DL-7A大容量低速冷凍離心機 |
| 實驗步驟 | 葡糖糖凝膠過濾層析法 1.葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡 (1)柱材處理 稱取一定量的SephadexG-200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現為止。 (2)裝柱 將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產生氣泡，影響蛋白質分離速度，濃度過低易產生凝膠分層，影響蛋白質的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。 (3)平衡 在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝膠。 2．上樣：將粗酶液上柱。 3．洗脫：用0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4（內含0.001MEDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質分析測定。 4．測定酶活性和蛋白質濃度。 |
| 注意事項 | 0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4(內含0.001MEDTA)配制時配×10倍濃縮液1000ml。 |
| 其他 | 調節PPO表達是未來研究熱點．一方面因為受傷或衰老會導致黑色素的形成，負調節PPO能大量提高作物的質量。另一方面PPO的過度表達能減少害蟲對作物的侵害，或通過影響植物蛋白形成抗營養機制，或在毛狀體滲出液中通過它啟動聚合作用捕獲昆蟲。因此負調節PP0表達或調節PPO使其過度表達在生產及應用方面都具有很好的前景及重要的實際意義。 |