這種溫和的方法（改進自 Godson and Vapnek 1973 ) 在處理大質粒（>15 kb ) 時較堿裂解法和煮沸法好。但溫和的代價是產量低：有相當數量的質粒 DNA 混于細胞渣滓中，在操作的早期步驟中丟失。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 這種溫和的方法（改進自 Godson and Vapnek 1973 ) 在處理大質粒（>15 kb ) 時較堿裂解法和煮沸法好。但溫和的代價是產量低：有相當數量的質粒 DNA 混于細胞渣滓中，在操作的早期步驟中丟失。 |
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| 試劑、試劑盒 | 抗生素氯霉素氯仿EDTA乙醇NaClSDSSTETris-蔗糖溶菌酶限制性內切核酸酶 |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠LB、YT 或 Terrific 培養液硬質玻棒 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 用于質粒篩選的抗生素
(2) 氯霉素（34 mg/ml )
(3) 氯仿
(4) EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0 )
(5) 乙醇
(6) NaCl ( 5 mol/L)
(7) 酚：氯仿（1:1，V/V )
(8) SDS ( 10%，m/V )
(9) STE，冰預冷
(10) TE ( pH 8.0)
(11) Tris-蔗糖
2. 酶和緩沖液
(1) 溶菌酶（10 mg/ml )
(2) 限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠
4. 培養基
LB、YT 或 Terrific 培養液
5. 離心機和轉頭
(1) Beckman type-50 超速離心機或與其相當的離心機，Oak Ridge (橡樹脊）塑料離心管（30 ml 帶螺口蓋，Nalgene 產）
(2) Sorvall GSA 轉頭或與其相當的轉頭
6. 專用設備
硬質玻棒
二、方法
1. 細胞的準備
(1) 在含適當抗生素的 30 ml 培養基（LB、YT 或 Terrific 培養液）中接種單一的轉化細菌菌落或 0.1~1.0 ml 培養自單一轉化子的對數晚期菌液。
(2) 劇烈振搖培養至細菌進入對數生長晚期（即 OD600 為 0.6 ) 。
為了確保培養物通氣良好：試管的體積應該至少比細菌培養物的體積大 4 倍；試管不宜蓋緊；培養物應在劇烈振搖下培養。
(3) 在 2 L 三角燒瓶中含適當抗生素的 500 ml LB、YT 或肉湯（預熱至 37℃，2L 培養瓶）中接種 25 ml 對數晚期菌液。37℃，劇烈振搖約 2.5 h ( 250 r/min）。
最終培養液 OD600 應為約 0.4。由于含不同質粒的不同菌株或同一苗株的生長速度不盡相同，因此有時達到合適密度的培養時間可能稍長或稍短于 2.5 h。
(4) 對于拷貝數低或中等的松弛型質粒，加入 2.5 ml 濃度為 34 mg/ml 氯霉素。培養液中氯霉素終濃度應為 170 μg/ml。
重要：對于高拷貝質粒，不必添加氯霉素。
(5) 37℃，劇烈振搖，12~16 h ( 250 r/min )。
(6) 從培養液中取 1~2 ml 于干凈離心管中，4℃ 保存。其余于 4℃ 2700 g ( 對于 Sorvall GSA 轉頭為 4100 r/min）離心 15 min 收集細菌。棄上清。將離心瓶倒置，使所有上清流盡。
(7) 細菌沉淀用 200 ml 冰預冷的 STE 重懸。按步驟 6 離心，在離心瓶中保存細菌沉淀于 -20℃。
(8) 從步驟 6 保存的 1~2 ml 菌液中提取質粒 DNA。用適當的限制酶消化和瓊脂糖電泳確定大量培養物中的質粒得到正確擴增。
這一步似乎顯得多余，但提供了有價值的確證，從而防止產生難以挽回的錯誤和浪費大量的時間。
2. 細胞的裂解
(1) 將步驟 7 的凍存細菌沉淀置室溫 5~10 min 融化，用 10 ml 冰預冷的 Tris-蔗糖溶液重懸，將懸液移入 30 ml 塑料螺口管中。
(2) 依次加入 2 ml 新鮮的溶菌酶溶液 ( 10 mg/ml ) 和 8 ml 0.25 mol/L EDTA ( pH 8.0 )。
(3) 溫和顛倒管子數次以混勻懸液，冰上放置 10 min。
溶酶菌和 EDTA 聯用可破裂細菌胞壁，并使外膜穿孔，所得原生質球盡管可滲漏，但在等滲的蔗糖溶液中是穩定的。
(4) 加 4 ml 10%SDS，立即用玻棒混勻，使 SDS 在細菌懸液中均勻分布。為減少釋出的染色體 DNA 斷裂，操作應盡可能溫和。
(5) 一旦混勻，立即加入 6 ml 5 mol/L NaCl ( 終濃度 1 mol/L），再用玻棒溫和徹底地混勻。置冰上至少 1 h。
3. 質粒 DNA 的回收
(1) 于 4℃ 離心 30 min，7100 g ( Beckman Type 50 轉頭為 30000 r/min)，以去除高分子質量 DNA 和細菌碎片。小心將上清移入 50 ml 一次性塑料離心管，棄沉淀。
如果細菌沉淀不密實，則重新離心 20 min，96000 g（Beckman Type 50 轉頭，35000 r/min），并將上淸盡可能多地轉移至干凈管中。棄去離心管中余下的黏稠液體。
(2) 上清用酚：氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。
(3) 將水相轉移到 250 ml 離心瓶，加 2 倍體積（約 60 ml ) 乙醇，混勻，室溫放置 1~2 h。
(4) 收獲質粒：4℃ 離心 20 min，5000 g ( Sorvall GSA 轉頭為 5500 r/min 或 Sorvall HS4 水平轉頭為 5100 r/min)。
對于此步，水平轉頭比角轉頭好，這是因為其可將質粒聚集于瓶底而不是布滿管壁。
(5) 棄上清，室溫下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁，然后按步驟 4 離心。
(6) 盡可能將乙醇倒盡，將離心瓶倒置于一疊紙巾上，使乙醇流干。用真空抽吸器抽干離心瓶壁上的乙醇小滴。倒置離心瓶直至無乙醇殘留。這時沉淀應保持濕潤。
(7) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解濕潤的質粒沉淀。
(8) 用商品化樹脂或用 CsCl-溴化乙錠等密度梯度離心進一步純化粗制的質粒 DNA。
大質粒（>15 kb ) 容易在純化質粒的多次聚乙二醇沉淀中產生缺口。
(9) 依次用限制酶消化和凝膠電泳鑒定質粒的結構。 |
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