TNF的生物活性測定

1． 材料和試劑

1.1培養液A ：DMEM培養液添加10%的胎牛血清（FBS）。

1.2培養液B：DMEM培養液添加10%的胎牛血清（FBS）和終濃度為0.7--1μg/ml

的放線菌素D。

1.3 L929細胞株：鼠結締組織纖維母細胞，來源于22天雄性C3H鼠皮下組織。

1.4 結晶紫染色溶液：0。05%結晶紫 (50mg結晶紫加入20ml乙醇,加蒸餾水定容至100ml)，蒸餾水稀釋。

1.5 脫色液：（1）乙二醇獨甲醚50%，蒸餾水稀釋。

（2）乙醇50%，乙酸0.01%(V/V)，蒸餾水稀釋。

1.6 胰酶：消化貼壁L929細胞。

1.7 半效稀釋度TNF標準品：1000IU/ml。

2. 實驗用具

超凈工作臺，細胞培養烘箱，酒精燈，顯微鏡，細胞計數器，微量移液器，細胞培養板，細胞稀釋槽，酶標儀。

3. 操作步驟

3．1樣板：棄L929細胞培養瓶中的培養液，加入800—900μl胰酶消化細胞，細胞收縮后，棄胰酶，加入4ml培養液A，吹打細胞，混勻，用細胞計數板在顯微鏡下計數，并計算所需細胞總數，培養液體積，將消化好未貼壁的細胞重新懸浮于完全培養液A，并調整細胞濃度為10×104/ml左右并將細胞接種于96孔培養板中，每孔100μl,37°C，5%CO2培養過夜或24小時，待細胞貼滿板壁80%以上時，方可加樣。

3．2 樣品處理和稀釋：將待測樣品和標準品用培養液B溶解至1 ml，（樣品為凍干粉狀）。如標準品為1000IU/ml，10倍稀釋至100IU/ml作為起始濃度，樣品則根據實際情況都做10倍梯度稀釋，并以最低濃度定為起始濃度（以上操作均在24孔板中操作）。

從樣品和標準品中的起始濃度中取200μl加入到96孔板A2-A12中，其余各孔均加入150μl培養液B，再從A2-A12中各取50μl，對 B-H各排進行逐級四倍梯度稀釋。

3．3 加樣：標準品和樣品經稀釋后，吸去已經培養好的細胞培養板中的上清液，每孔依次加樣100μl，并在邊緣未加樣的各孔加入100μl培養液B，消除邊緣效應，放入烘箱37°C，5%CO2，培養過夜。

3．4 染色和脫色：L929細胞培養過夜后，鏡檢在半數死亡孔到達D或E時終止反應，吸取上清，輕輕吹打2—3次，除去死細胞，每孔加入染色液30μl，靜置5 分鐘左右。

用流水輕輕沖掉染色液，每孔加入100μl脫色液脫色，輕輕搖動使脫色完全，然后于酶標儀570nm波長下比色，測O.D.值,并設對照。

4. 處理數據:在座標紙上以570nm O.D.值(雙孔加樣測兩點值的平均)對稀釋倍數做圖,并以標準品的最低,最高O.D.之平均值做一平行于X軸的直線交各曲線,以各相應曲線與該直線交點在X軸上讀出半效量的稀釋度,按下式計算效價:
TNF成品活性(IU/ml)=標準品效價*(樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數)*(標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效量的稀釋度)