WesternBlot詳解（七）

TTT.目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％T丙稀酰胺（2.6％C）濃度為16.5％，另外兩層都用30％丙稀酰胺，中間一層濃度為10％，積層膠濃度為4％，凝膠厚度1mm，轉膜的條件試過30V70分鐘，膜上可見到小分子蛋白marker的條帶，似乎見到目的條帶，上樣量為60μg細胞胞漿總蛋白，轉膜的條件怎么樣合適？
解答：一定要用0.2μm的膜，并且轉移的條件要摸索一下，小分子的Western不好做，要根據你的實驗器材來定，一般你要是有prestained marker就可以參照一下，如果相應的分子量大小的marker轉移的好就可以了。

UUU.怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上樣的量很重要，罐膠有什么技巧嗎？想跑漂亮，是不是應該先小電壓，再高電壓，總體上電壓小些會跑的好些?還有前面有人說電泳液平玻璃板會使電泳條帶漂亮些?
解答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：1、電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好。2、膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。

VVV.為什么提高大分子量蛋白的轉移的時候，小分子量蛋白會丟失一些哪?什么原因?
解答：小分子的蛋白在轉移過程中，會透過膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透過去了。

WWW.上次轉染了1.6*106細胞，收集，收集到了400微升體積，加6*loading buffer， 95度煮5分鐘，-20度，交替3次，離心，上樣，7%分離膠，先80v跑進分離膠，在100v電泳至溴酚蘭出膠，biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘，預染marker全部進膜，轉移后的膠考馬斯亮蘭染，可見殘留的蛋白帶，大分子量多些.blot時，封閉用5%奶粉TTBS 1小時，抗體稀釋液TTBS，一抗(1:10，單抗上清，2000年制備)1小時，二抗(1:2000)1小時，均在室溫.結果，50kd的小分子顯色，160kd大分子未顯色。
原因分析及準備改進：轉染大容量的質粒(融合蛋白的質粒)的效率會相對較低，大分子量表達也會相對較低，加上大分子量蛋白的轉移不完全，可能是我沒有拿到大分子量條帶結果的原因。另外背景稍微有一些臟(背景整體均勻一致)，估計是二抗的濃度高了些，準備降至1:5000，另外抗體稀釋液準備改用5%奶粉TTBS，封閉改為室溫2小時。這個過程有沒有問題？
解答：首先分析你的整個實驗步驟。我發現了兩個比較大的毛病：
1、一抗用TBST稀釋。按照我的理解，一抗最好用5%的TBST脫脂牛奶稀釋，和你的封閉液相一致，這樣可以降低背景。
2、“biorad半干轉PDVF膜，15v轉30分鐘”，你是這么做的嗎？因為我大部分時間是做的恒流轉移，用的是0.1mA/膜，100kd--200kd轉2小時。到最后電壓會升到20v左右。你用恒壓法，我不是很肯定你轉30分鐘能將大分子（160kd）的抗原轉上去。我建議你最好能將時間延長，如果是恒流，可按我的做法；如果是恒壓，可摸索一下，適當延長時間。有時候你的marker也有可能欺騙你，因為marker的量比較大，是很容易轉上去的，實際上目標蛋白的量遠遠少于marker量。
我對你的結果分析如下：
1、你的結果很好，估計離目標不遠了，很快就可以成功。
2、 沒有160kd的帶是因為你的轉移時間過短，適當延長轉移時間（我懷疑這是主要的問題）。
3、你的一抗用1：10，2抗可以降到1：5000，背景會低一點。

10.方法的介紹

XXX.我想將hbx轉到hepg2 細胞里 通過檢測hbx蛋白的水平來 檢驗轉染的效率 不知道可不可行？
解答：Western Blot檢測HBX蛋白的表達來檢測轉染效率不是一個好辦法，建議還是：
1、最好是帶有熒光標簽的HBX轉染來看轉染效率，最可靠
2、其次，HBX和熒光載體共轉染，相對說明問題
3、熒光載體單獨轉染，主要是看細胞好不好轉了呵呵
轉染效率高低熒光顯微鏡下一目了然了。有的細胞熒光強，有的細胞熒光弱，有的沒有。所以HBX表達強很可能是少數細胞熒光強的結果，不代表轉染效率。

YYY.半干法轉移與膠的面積和蛋白分子兩大小好像都有關系，那么濕法轉移是不是所有的轉移條件都一樣呢？一般的條件是怎樣的？
解答：半干轉的電流大小是按照面積來算的，時間是根據蛋白分子大小定的；而濕轉的話電流是恒定的，時間也是根據分子量而定。

ZZZ.轉膜時何為濕法，何為半干法？
解答：半干法和濕法轉移是兩種不同的轉移裝置下的轉移系統，將膜，膠，濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來做轉移體系的叫半干法。

AAAA.為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致？同樣的電壓可以嗎？
解答：濃縮膠的目的使得loading 的樣品能夠在同一條水平線上進入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進入分離膠。而在分離是理論上（實際上也是）小電壓長時間分離的效果會更好，但是在操作過程中沒有必要等那么長的時間，所以就用大電壓快點跑。

BBBB.如果目的蛋白比較小，21和38kd，轉膜時（Biorad的濕轉儀）時間是否能縮短些？100伏電壓，甲醇的量是否也可以相應增加？

解答：如果是小蛋白可以用小電壓28V－36V，4－6hours，（4度）。甲醇10％－20％就可以了。

11.結果分析

CCCC.條帶有時清晰，有時很散，不知為何？
解答：可能原因：樣品可能存在降解；轉膜不及時造成擴散；轉移緩沖液甲醇濃度（ＮＣ膜可加到２０％，ＰＶＤＦ加到１５％）。

DDDD.顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，應該是高表達。每個涌道上50-70μg蛋白，開始用半干轉移，后來用濕轉14v，16h，用PVDF膜轉移。膠轉移后染色檢測，發現小分子量的基本轉移走了，可是為什么條帶老是不粗不濃呢?
解答：可能跟你的一抗有關系，還有應該高表達，那實際做的陽性對照是否是高表達；還有跟抗原量相關，你多上點蛋白會好的多；跟顯色條件相關。