細菌的革蘭氏染色和特殊形態觀察

實驗原理

染色方法：
革蘭染色法是細菌學中zui廣泛使用的一種鑒別染色法。1884 年 由丹麥醫師 Gram 創立。方法是先將細菌用結晶紫染色，加媒染劑（增加染料和 細胞的親和力）后，用脫色劑（酒精或丙酮）脫色，再用復染劑染色。如果細菌 不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G＋)；如被脫色，而染上復染液的顏 色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細胞壁的細菌分為兩大類：革蘭 陽性菌和革蘭陰性菌。

單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構造等。

復染色法：用兩種或兩種以上染色液進行染色，有協助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

染色原理： 現在認為細菌對革蘭染色的不同反應主要是革蘭陽性菌和陰性菌 的細胞壁結構與化學組成不同。革蘭陽性菌的細胞壁較厚，肽聚糖含量多，且交 聯度大，脂類含量少，經 95％乙醇脫色時，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低， 與細胞結合的結晶紫與碘的復合物不易被脫掉，因此細胞仍保留初染時的顏色。 而革蘭陰性菌的細胞壁較薄，含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少，乙醇脫 色時溶解外層類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易 于滲出，結果細胞被脫色，經復染后，又染上復染的顏色。

實驗試劑

革蘭氏染色液一套 
結晶紫
碘液
95%乙醇
番紅花紅
孔雀綠

實驗設備

顯微鏡
蓋玻片
載玻片

實驗材料

菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌

實驗步驟

1. 革蘭氏染色 
  （1）涂片

  （2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。

  （3）媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。

  （4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。

  （5）復染：滴加番紅染色液，染3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 

  （6）鏡檢：觀察染色結果并繪圖。

2. 染色過程：涂片（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（結晶 染色過程： 紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脫色（1min）→復染（番紅花 紅染色 1min）→干燥→鏡檢（油鏡）

3. 油鏡的使用與保養
  （1）在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉動油鏡，在轉 換油鏡時，從側面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而 又不以壓破載玻片為宜。 
  （2）用雙眼觀察目鏡，并慢慢轉動粗調節器至出現模糊物象，然后用細 調節器至物象清晰為止。 
  （3）如果不出現物象或者目標不理想要重找。 
  （4）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許乙醇將鏡頭上和標本上的香柏油 擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。

注意事項

1. 菌種應選用對數期的菌種； 
2. 涂片不易過厚，涂片薄而均勻為好； 
3. 脫色不足或脫色過度均會造成革蘭染色的假陽性或假陰性，脫色時間 取決于涂片厚度、室溫等；
4. 實驗結束請確保油鏡頭擦拭干凈。