鄒鵬／王建斌合作發展空間特異性RNA標記技術

　　真核細胞轉錄組在三維空間中的分布特征對于基因表達具有重要調節作用。在記憶形成、胚胎發育、細胞增殖等一系列生理學過程中，細胞通過將特定RNA分子選擇性富集在亞細胞區域，能夠實現對蛋白質翻譯過程的精準調控，或幫助建立和維持染色體三維結構。因此，發展一種能在轉錄組層面解析細胞中RNA三維空間定位的方法，對于深入理解RNA功能具有重要意義。

　　傳統研究手段往往依賴于針對細胞器的機械分離技術，例如利用密度梯度離心法純化細胞核、線粒體、突觸小體等亞細胞結構，進而通過高通量測序分析樣品中RNA成分。這類技術的通常局限于那些具有穩定膜結構的細胞組份，而難以有效分離無膜包被的細胞區域（例如線粒體外膜）。近年來，隨著超分辨成像技術的進步和細胞原位測序方法的發展，人們已能夠對細胞內上千種RNA分子同時進行成像觀測。然而目前基于成像的手段依然受限于空間分辨率和分析通量，而且依賴于已知RNA序列。因此，我們迫切需要一種具有高時空分辨能力、適用于活細胞的空間轉錄組研究技術。

　　2019年10月7日，北京大學鄒鵬團隊聯合清華大學王建斌團隊在Nature Chemical Biology雜志上發表長文Mapping spatial transcriptome with lightactivated proximity-dependent RNA labeling，發展了一種基于光敏化學反應的空間特異性RNA標記技術。利用可遺傳定位的光敏蛋白質miniSOG在細胞中原位產生活性氧自由基，短時間內對附近的RNA進行化學修飾，隨后從細胞中提取和純化修飾的核酸，并利用高通量測序技術檢測標記位點。該方法可實現在細胞天然環境下標記線粒體、內質網等重要細胞器附近的RNA分子。經過富集和高通量測序鑒定，實現在全轉錄組水平上分析RNA成分，并在此基礎上發現了協調線粒體-細胞質蛋白質翻譯的新機制。

　　研究人員首先在體外實驗中比較了各類光敏分子在可見光照條件下對核苷的氧化損傷能力，挑選出可遺傳編碼探針miniSOG。在藍光照射下，miniSOG產生的單線態氧迅速進攻鳥嘌呤，生成的氧化中間體被含有氨基的探針捕獲形成共價加成產物。研究人員將這一方法命名為Chromophore-assisted proximity labeling and sequencing，簡稱CAP-seq。由于單線態氧擴散距離有限，該反應只在miniSOG附近幾十納米范圍內發生，具有良好的空間特異性。為了驗證這一點，研究人員將miniSOG表達在線粒體基質，成功捕獲了線粒體中全部15個長鏈RNA，而沒有富集到細胞質中的高豐度RNA。

　　研究人員進一步將CAP-seq方法擴展到研究內質網表面與線粒體表面的轉錄組。在內質網膜附近CAP-seq捕獲的372個mRNA中，高達96.2%編碼分泌途徑蛋白或膜蛋白。這一結果與內質網表面的蛋白質局部翻譯模型一致，證明了CAP-seq在開放的細胞質空間中也具有高空間分辨率。接下來，研究人員應用CAP-seq技術對哺乳動物細胞線粒體表面的轉錄組進行了解析。研究人員捕獲到的411個mRNA中，27%編碼線粒體蛋白質，多達50%定位于線粒體內膜上，并且其中有33個為氧化磷酸化途徑相關蛋白。這些結果支持了線粒體蛋白在線粒體外膜被翻譯后直接轉運進線粒體的模型。同時還發現了多達62個編碼胞質核糖體蛋白的mRNA，暗示著哺乳動物細胞中線粒體-細胞質蛋白質翻譯可能通過調控編碼胞質核糖體蛋白亞基mRNA在線粒體表面的局部翻譯來實現。

　　總之，本文主要發展了在活細胞中空間特異性標記RNA的化學生物學新技術CAP-seq。由于miniSOG分子量約為GFP的一半，可以較容易通過蛋白融合手段定位于感興趣的亞細胞區域，標記所需的小分子探針也能很容易擴散進入細胞，光控標記具備優良的時間分辨能力，因此CAP-seq具有廣闊的應用前景。

　　專家點評

　　何川（HHMI研究員、芝加哥大學化學系終身教授 、John T. Wilson Distinguished Service講席教授）

　　自從2013年Alice Ting實驗室報道了基于APEX的線粒體蛋白組學分析技術以來（Science, 2013, 鄒鵬為共同第一作者），以臨近標記技術為基礎的亞細胞水平蛋白組學分析已經推動了細胞增殖分化等多個領域的研究發展。蛋白質的亞細胞定位受多個層面因素的調控，除了蛋白質的定向轉運以外，基于mRNA定向分布的蛋白質翻譯空間調控也是重要環節。然而，能有效標記RNA的化學手段非常有限。由于技術的限制，針對mRNA的亞細胞水平分析一直未曾實現。今年早些時候，Alice Ting實驗室(Cell, 2019)和鄒鵬實驗室(Angew Chem Int Ed, 2019)分別報道了經過優化的基于APEX的RNA臨近標記技術，但標記效率較早前的蛋白質標記還有很大差距，影響了其在實際研究中的應用。

　　今天上線的這篇文章中，來自北京大學鄒鵬實驗室和清華大學王建斌實驗室的研究人員基于一個新的臨近標記酶miniSOG開發出了針對RNA的高效標記技術。這一新化學標記技術利用miniSOG產生的自由基和鳥嘌呤反應，跳出了原有APEX體系的限制，可以更加精確的控制標記區域，有效區分線粒體基質和外膜區域的RNA組成。此外，在本篇文章中，研究人員還發現核糖體蛋白mRNA的空間定向分布，預示著除了mRNA空間分布和蛋白質定向運輸之外，翻譯效率的定向分布也是影響細胞內蛋白質分布的重要因素之一。相信這篇文章介紹的基于自由基的標記方法將引領一批相關技術開發的熱潮，同時進一步推進多個領域的快速發展。