骨肉瘤的新細胞起源以及STK11／LKB1對骨癌的發病影響

　　中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所和中山大學腫瘤防治中心/腫瘤醫學協同創新中心等機構的研究人員利用條件性敲除的成骨腫瘤小鼠模型，鑒定出骨膜源性Ctsk-Cre細胞是成骨腫瘤的起源細胞，并提出一個治療成骨腫瘤的有希望的新靶點——LKB1-mTORC1途徑。

　　【背景】

　　成骨腫瘤（osteogenic tumor）是骨組織最常見的原發性腫瘤，包括良性骨形成腫瘤、骨瘤、成骨細胞瘤和惡性腫瘤（又稱為成骨源性肉瘤或骨肉瘤）。骨肉瘤主要在兒童和青少年人群中高發，老年人位列第二發病率高峰。由于傳統化療生存效益不理想，因此預后較差，當前迫切需要更多針對性和個性化的治療骨肉瘤的方法。

　　越來越多證據表明，小鼠模型可以概括人類骨肉瘤的基本方面，并提供靶向治療目標。利用轉基因小鼠或基因敲除小鼠模擬人類癌癥已經被證明可以顯著地加深我們對腫瘤形成的確切細胞來源以及信號通路的理解。

　　以往的研究表明，p53和/或Rb基因突變以及其他成員參與鼠模型和人類骨肉瘤患者起源，破壞間充質祖細胞（Prx1-cre）、成骨細胞前體細胞（Osx-Cre）和成骨細胞定向細胞（Col1a1-Cre和OCN-Cre）的p53/Rb，可以導致骨肉瘤，間接證明間充質起源和成骨譜系細胞對成骨腫瘤的形成負責，另外，定向成骨細胞（Col1a1-Cre）的NOTCH激活足以誘導骨肉瘤說明定向成骨細胞可能是成骨腫瘤的一個潛在來源。然而，對不同亞型的基因突變的確切細胞起源仍有待描述。

　　LKB1，由Stk11編碼，主要通過mTORC1途徑控制關聯能量動態平衡和細胞生長的絲氨酸/蘇氨酸激酶。缺失LKB1可引起增生和腫瘤。LKB1失活的癌癥往往表現出侵襲性，對治療的敏感性與LKB1未失活的癌癥不同。LKB1可能與骨癌有關。最近的一項研究表明，41%骨肉瘤患者LKB1蛋白表達下降，大多數患者的mTORC1激活。雖然認為LKB1丟失與成骨腫瘤有關，但相關的細胞類型和潛在途徑尚不清楚。

　　組織蛋白酶K（Cathepsin K，Ctsk）是一種由破骨細胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，對骨吸收過程中的基質膠原的降解至關重要。Ctsk啟動子僅對破骨細胞有活性，Ctsk-Cre小鼠被廣泛用于破骨細胞功能研究，最近一項研究指出，當刪除Ctsk-Cre細胞的Ptpn11，Ctsk-Cre可以是軟骨細胞祖細胞，通過激活Hedgehog信號導致混合性軟骨瘤病。刪除軟骨細胞Lkb1（Col2a1-Cre）導致骨骼生長板顯著破壞以及軟骨腫瘤形成，Ctsk-Cre細胞的Lkb1缺失可導致軟骨腫瘤。

　　【方法和結果】

　　有趣的是，新研究發現，Ctsk-Cre細胞的Lkb1缺失導致了成骨源性腫瘤樣表型，而并非軟骨腫瘤。譜系追蹤表明，Ctsk-Cre可標記為骨膜源性細胞群，根據標志和功能特性可定義為間充質祖細胞，換句話說，Ctsk-Cre細胞可以作為軟骨腫瘤和成骨腫瘤在不同信號調節作用下的祖細胞。其中，mTORC1抑制劑具有治療骨肉瘤的潛力。

　　這項研究發現了成骨腫瘤的一個新細胞起源，并指出Lkb1在原發性骨腫瘤中充當腫瘤抑制因子的角色，從而提高了我們對兩種細胞的認識。成果發表在《The Journal of Clinical Investigation》（最新影響因子13.251），題為“Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation”。

　　1. Ctsk-Cre細胞的Lkb1缺陷可引起成骨腫瘤樣腫瘤表型

　　為了調查Lkb1在Ctsk-Cre細胞中的作用，研究人員分別構建了Ctsk-Cre小鼠和Ctsk-CKO小鼠，缺乏Lkb1的軟骨細胞系（Col2a1-Cre）。由于Ctsk-Cre細胞被認為是間軟骨瘤（metachondroma）的來源，推測缺乏Lkb1的Ctsk+細胞會導致軟骨癌。然而，令人驚奇的是，Ctsk-CKO小鼠并未表現出軟骨癌，反而呈現出一種特殊的骨骼表型。KO鼠在13周齡以前表現為過度生長，13周后體重下降。85%的KO鼠死于30周齡前。

　　Ctsk+細胞缺乏Lkb1，致密骨腫瘤樣聚集，與細胞周期有關的基因（包括Ccnd1、Cdkn1a、Cdkn2a和Cdkn2b）顯著增加，Ctsk-CKO小鼠骨肉瘤原癌基因Mdm2和Notch靶向基因Hey1表達升高，它們在骨肉瘤患者和小鼠模型中同樣頻繁上調。相反，Rb和Bub3等抑癌基因表達下調（圖1）。

圖1. Ctsk-Cre細胞的Lkb1缺陷可引起成骨腫瘤樣腫瘤表型

　　之后，研究人員將Ctsk-CKO小鼠與對照小鼠（Ctsk-Ctrl）進行比較，定量微量 X射線斷層掃描和RT-qPCR結果表明，致密骨厚度和異位骨形成增加，但骨體積和組織體積百分比下降，前成骨細胞標記Alp和Col1a1特異性增加，Ctsk-CKO小鼠骨形成激活，根據觀察到的成骨細胞活性增加，腫瘤主要由成骨細胞組成（圖2）。

圖2. 敲除Ctsk-Cre細胞的Lkb1導致骨形成增加

　　2. 破骨細胞前體細胞的Lkb1缺陷不會誘導成骨腫瘤樣表型

　　破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色發現，Ctsk-CKO小鼠的骨膜、骨內膜和松質骨的破骨細胞數量增加。研究人員還利用Ctsk-CKO和Ctsk-Ctrl小鼠的骨髓細胞分化為破骨細胞。TRAP活性定量顯示，來自Ctsk-CKO骨髓細胞的破骨細胞形成增加（圖3），說明Ctsk-CKO小鼠的骨量增加并非因為再吸收受損。其他實驗排除了Ctsk-CKO小鼠的成骨腫瘤樣表型與破骨細胞功能改變有關。

圖3. 破骨細胞前體細胞缺失Lkb1不會造成成骨腫瘤樣表型

　　3. Ctsk-Cre成骨間充質細胞是成骨腫瘤的潛在來源

　　細胞譜系追蹤顯示Ctsk-Cre陽性LysM-Cre陰性細胞群位于致密骨的骨膜內（圖4）。隨著年齡增長，Ctsk-CKO小鼠的Ctsk-Cre陽性細胞不斷擴張填滿了脛骨的致密骨。20周齡前，GFP陽性細胞形成脛骨Ctsk-CKO小鼠的骨樣腫瘤，暗示成骨腫瘤來自LKB1缺失本身。

圖4. Ctsk-Cre骨膜間充質干細胞是成骨腫瘤的新型潛在來源

　　接著研究人員分析了Ctsk+細胞的通用干細胞標記表達情況，發現Sca1、CD24、CD44、CD49f 和CD146都有表達。隨后采用賽業生物（Cyagen）干細胞定向誘導技術，體外觀察骨膜Ctsk+細胞的分化潛能，證明它們可以分化為成骨細胞和軟骨細胞，以及表達相應的分化標志物。換句話說，Ctsk+可定義為一群間充質干細胞。

　　4. LKB1抑制Ctsk+骨膜間充質干細胞的自我更新和成骨分化能力

　　鑒于Ctsk+骨膜間充質干細胞的角色，這項研究首次發現Lkb1可以抑制這些細胞的自我更新能力以及成骨分化能力。

　　為了驗證，Lkb1缺陷是否足以驅動正常小鼠的成骨腫瘤形成。研究人員分別將對照小鼠和Ctsk-CKO的骨膜源性細胞進行裸鼠皮下注射移植。8周后，HE染色和共聚焦成像顯示，Ctsk-CKO組骨樣基質的細胞和核表現出腫瘤異型性和腫瘤形成特征。

　　隨后，抑制mTORC1信號可以改善Ctsk-CKO小鼠腫瘤進展，并阻止異種移植模型的腫瘤生成。

　　【總結】

　　本研究證明了骨膜Ctsk+細胞的LKB1缺失導致成骨腫瘤樣表型，介導途徑為mTORC1的活動增加，澄清了Lkb1在人類骨肉瘤生成中的作用。此外，擴展了Ctsk+細胞的定義，即它們不僅是一類新型骨膜間充質祖細胞，而且還是骨肉瘤的來源。

　　骨髓瘤治療可以靶向多條通路的聯合療法以期取得協同效應，例如，理論上采用雷帕霉素結合抗VEGF療法，治療LKB1損傷的骨肉瘤患者。LysM+細胞缺失Lkb1后不會導致致密骨腫瘤形成，說明破骨細胞沒有參與Lkb1相關骨肉瘤發病機理。而實際上，Ctsk-CKO和LysM-CKO小鼠都表現出破骨細胞形成（圖3），Ctsk-CKO小鼠富含大量破骨細胞和破骨細胞前體細胞，意味著Lkb1可能在破骨細胞生成方面起到一定作用，未來，研究人員準備進一步調查Lkb1影響破骨細胞生成的具體角色。