定量PCR標準化，挑戰在哪里？
六年前，科學家針對實時定量PCR實驗中的種種問題，提出了一套統一的評估標準——MIQE指南。兩年前，數字PCR版本的MIQE指南也出爐。然而，認真執行MIQE指南的實驗室并不多。定量PCR標準化，挑戰在哪里？Jeffrey Perkel博士近日在《BioTechniques》上討論了這一問題。 當零基礎的人們準備開展定量PCR時，大多會請教師兄師姐。不過，對于數字PCR（dPCR）這種比較新的技術，周圍的人未必有經驗。同時，這種技術不像傳統PCR那么簡單，需要用到專門的儀器、操作和變量。Perkel認為，若未經培訓的研究人員利用dPCR來定量mRNA的豐度，他們也能獲得一個數字，但這個數字是否能準確代表樣品本身，就不好說了。 幸運的是，一組研究人員已經開發出dPCR實驗的路線圖，稱為digital MIQE指南。這個指南能夠指導研究人員開展dPCR，包括實驗設計和分析。digital MIQE論文的主要作者，LGC公司的......閱讀全文
銀染實驗用水指南
SDS聚丙烯酰胺凝膠染色是蛋白質研究的一個基礎方法。染色方法有很多，實際應用中，考馬斯亮藍染色（考染）和銀染是運用的最多的方法。考馬斯亮藍G250在游離狀態下呈紅色，它與蛋白質結合后變為藍色，結合物在595 nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。銀染實驗中
實驗小鼠運輸指南（一）
大家好，我是一只來自邦耀實驗室SPF級動物房的基因編輯小鼠，聽實驗室的哥哥姐姐們說現在外面已經30多度的高溫了，在外面呆幾分鐘就能汗流浹背。雖然我沒有汗腺，但是光想象一下就覺得鼠生艱難啊…不過上完最后一節課就要放暑假，去一個新的環境、參與完成一項偉大的實驗了~但是我們中有的是短途貨車出行，有的是長途
實驗小鼠運輸指南（二）
2.?裝載密度運輸時注意降低運輸箱盒中動物的密度，保證動物舒適地站立、躺臥或轉身，可減輕應激反應。例如規格450×250×160 mm的小型運輸箱內放入的小鼠總量最好不超過10只，規格600×400×200 mm的大型運輸箱內放入的小鼠總數最好不超過20只。如果運輸的小鼠周齡較大或者在飼養過
Northern－Blotting－實驗操作指南
實驗概要本文介紹了Northern Blotting實驗詳細操作流程。實驗材料1. 試劑盒提供NorthernMax (Formaldehyde-Based System for Northern Blots)[Catlog#1940]6ml?? -20℃????? Formaldehyde Loa
實驗動物采血完全指南
采血方法的選擇，決定于實驗的目的所需血量以及動物種類。凡用血量較少的檢驗如紅、白細胞計數、血紅蛋白的測定，血液涂片以及酶活性微量分析法等，可刺破組織取毛細血管的血。當需血量較多時可作靜脈采血。靜脈采血時，若需反復多次，應自遠離心臟端開始，以免發生栓塞而影響整條靜脈。例如，研究毒物對肺功能的影響、血液
實驗動物飼養用水指南
在生命科學、醫學和藥學研究領域，對一些難以在人身上進行的工作，需要使用動物來代替人類進行實驗研究。為了保證實驗科學、準確和重復性，我們需要將研究的生理或病理活動相對穩定地顯現在標準化的實驗動物身上。這些標準化的動物就稱之為實驗動物。常見的實驗動物包含：秀麗線蟲(caenorhabditis eleg
有機合成實驗入門指南－實驗裝置設置
實驗檢查玻璃儀器和反應設備。反應瓶是否有裂紋，滴液漏斗是否滲漏，油浴和磁力攪拌是否正常等。搭建裝置要重心平穩、安全，并保持十字平衡，各種反應一定在反應瓶下面放置保護的容器，以防發生意外泄漏（攪拌子打破瓶子，反應過速外溢）而無法回收原料及產品。選擇合適的反應瓶：對于均相反應，液面不超過容器的2/3；對
核酸分離純化實驗技術指南
?核酸分離純化實驗技術指南：? ? ? 總RNA提取常見問題分析? ? ? RNA降解? ? ? 1. 新鮮細胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如? 果將裂解液直接加入培養皿中裂解細胞，一定要使裂解液能覆蓋住細胞。?? ? ? 2. 新鮮組織：某些富含
熒光定量PCR實驗指南4
3.8 防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產物用來進行新的擴增反應時，會發生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。可以在PCR過
熒光定量PCR實驗指南5
您可以選擇熒光染料SYBGREEN體系，具體請參照說明書。您可靈活使用20-50ul間其他體積，注意保證終濃度相同。A2010A0106試劑盒:反應體系終濃度(自配熱啟動熒光系統)：1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+ 、0.2mM的dNTPs、1×PCRbuffer（A
熒光定量PCR實驗指南1
第一部分一、基本步驟：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；2、引物、探針的設計；3、引物探針的合成；4、反應體系的配制；5、反應條件的設定；6、反應體系和條件的優化；7、熒光曲線和數據分析；8、標準品的制備； 二、技術關鍵： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；
熒光定量PCR實驗指南3
3.3 引物、探針的純度和穩定性定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環過程，在每個堿基加入時使用重復化學反應，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環都
熒光定量PCR實驗指南2
2.3TaqmanMGB探針設計介紹MGB探針的優點：2MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區。2短片段探針(14-20bp)加上MGB 后，Tm值將提高10℃，更容易達到熒光探針Tm值的要求。2MGB探針的設計原則2探針的5’端避免出現G，即使探針水解為單個堿基
PCR實驗技術指南(引物設計)
所謂“工欲善其事，必先利其器”，這年頭手工設計引物的人似乎不多，還是用軟件方便些，防止你一不小心看走眼，丟一個堿基，同時計算起來也方便。設計軟件有很多，既可以在線設計(如Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)，
滴定理論指南－滴定實驗的定義、理論和實踐指南
本手冊首先介紹基本的滴定定義，然后通過示例、圖示和評估原則介紹了主要的滴定類型。滴定是一種分析技術，可以定量測量樣品中特定可溶性物質的含量。提供了解滴定所需的基本知識，說明各種不同的滴定類型，并解釋評估原則。特別提供了正確進行滴定所需的所有必要信息，以便獲得可靠的結果。最后，簡短介紹與滴定相關的化學
實驗室純水器選型指南
水是我們每天在實驗中接觸到的最多的試劑。水是非常好的溶劑，在很多實驗中水作為試劑直接參與反應，水也是常用的傳導熱的工具，我們的整個實驗過程可以說無法離開水。因為水的普遍和易得，往往讓我們忽略了它對實驗結果產生的影響。正確選擇純水儀器可以幫助研究人員避免許多不必要的麻煩。在挑選一款合適的純水器之前，我
分子克隆蛋白表達實驗指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the ? absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 ? 0.5
分子克隆蛋白表達實驗指南（十五）
? LB固體培養基????????? Tryptone????????????? 1g????????? Yeast Extract?????????? 0.5g????????? NaCl???????????????? 1g? Agar???????????????? 1.5g? 加蒸餾水至總體
分子克隆蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆蛋白表達實驗指南（十三）
7．? ? 電泳結束后，按比例從膠上割下相應約1cm條帶（當按比例的條帶割下后可相應的向兩邊再割一點，但是電透析時中間和兩邊的膠必須分開透析），用鑷子或尺子將膠碾碎成2mm見方的小塊。? 8．? 將碎塊小心加入電透析tube中，200V，120～150min。? 9．? 移出放電透析tube的架子，
分子克隆蛋白表達實驗指南（十四）
RbCl制備感受態細胞? 需準備的滅菌器具和培養液：? SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml廣口瓶，1.5ml ? EP管，1×500ml離心瓶（按200ml搖菌量計算），2×50ml離心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰? 離心管，EP管，移液管使用前均需要放
實驗室純水器選型指南
水是我們每天在實驗中接觸到的最多的試劑。水是非常好的溶劑，在很多實驗中水作為試劑直接參與反應，水也是常用的傳導熱的工具，我們的整個實驗過程可以說無法離開水。因為水的普遍和易得，往往讓我們忽略了它對實驗結果產生的影響。正確選擇純水儀器可以幫助研究人員避免許多不必要的麻煩。在挑選一款合適的純水器之前，我
分子克隆蛋白表達實驗指南（十六）
Amp(50mg/ml)??????? 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養基，1:1000比例稀釋?????? ????? Kan(50mg/ml)??????? 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆蛋白表達實驗指南（十）
13．連接產物轉化DH5α（預開42C水浴）?????? 與T載體轉化相同，先轉化DH5α，篩選及擴增目的重組質粒?????? 轉化DH5α后挑6～8個菌落驗證，驗證項目：? 1．? 目的基因引物PCR驗證? 2．? 表達載體引物PCR驗證? 3．? Step2中PCR產物膠回收后，以膠回收為模板、
實驗室馬弗爐安全操作指南
高溫爐是一種通用的加熱設備，主要供實驗室、工礦企業、科研單位作元素分析測定和合金鋼制品、各種金屬機件正火、淬火、退火等熱處理之用，還可作金屬、陶瓷的燒結、溶解、分析、金剛石切割刀片進行高溫燒結等高溫加熱用，也可以用在有機物固化燒結用。屬周期作業電爐。與一些高溫窯是有很大區別的，一般使用起來的實驗空間
PCR實驗技術指南之產物測序
1. DNA 直接測序：指直接分析不經分離的PCR 擴增產物，如果各個位點上堿基序列都是一致的，則所得信號是確定的，否則，在那些有相異堿基的位點出現模糊信號， 如果模板在多數情況下被正確擴增，則少數的突變將被掩蓋，這是結果顯示的是模板的序列.但是，當擴增的前幾輪即出現錯誤擴增并被后續的循環積累，這時
分子克隆蛋白表達實驗指南（十一）
SDS-PAGE膠樣品排列：??????? MarkerUII 37CUI’I’??????? Marker：低分子量蛋白marker，上樣10ul??????? UI：未誘導菌液，上樣10ul。任取37C和20C中一個??????? I：誘導后對照，上樣10ul??????? UI’, I’代表G
分子克隆蛋白表達實驗指南（一）
目的基因克隆包括保存用全長基因(gene for saving, GS)和表達用全長基因(gene for expression, GE)兩部分。? 這兩部分所克隆的基因都是全長片段，但克隆的策略及目的不同。直接用精確克隆(及引物從基因CDS兩端開始)很難找到高效價的引物，且cDNA中目的基
分子克隆蛋白表達實驗指南（七）
目的基因表達?? ?? 14．快速誘導表達? 快速誘導目的是為檢測該重組質粒在BL21中是否能被誘導表達重組蛋白，并確定在不同IPTG濃度蛋白誘導效率的差異。? 5．? 挑單克隆菌落于7ml含有相應抗生素LB培養液的50ml培養管中，37C振蕩培養過夜（8-16h）。? 6．? 37C，1mM ?