分子生物學實驗小技術
當找到可能的重組質粒且條帶清晰時可直接切下含DNA 的凝膠條帶，用膠回收DNA 的方法回收質粒并進行酶切鑒定，如果DNA 量太少則需重提質粒。 用QIAprep Miniprep Spin 小量提質粒注意以下事項可提高得率A．用含抗生素的培養基培養細菌會有較高的得率。B．收菌時用tips吸干凈殘余的培養基上清。C．加入Ｐ１后應充分振蕩以完全打散懸浮細胞，特別是多次離心收菌的情況下較難打散細菌，可用tips 反復吸打因為殘留的小塊菌團會嚴重影響得率和DNA 的質量。D．加入Ｐ２后立即輕輕搖勻，可反復倒轉epperdorf 管4-6 次充分混勻菌數較多時可靜置不超過5 分鐘，以便充分裂解提高得率，超過5 分鐘的會降低質粒質量。甚至可能出現部分質粒不可逆的變性的情況，可能在電泳時得到一條酶切不動的質粒條帶。E．加入Ｎ３后立即輕輕混勻，可反復倒轉epperdorf 管5-7 次以充分混勻。菌數較多時可靜置幾分鐘以便質粒充分復性。F．離心......閱讀全文
分子生物學實驗小技術
當找到可能的重組質粒且條帶清晰時可直接切下含DNA 的凝膠條帶，用膠回收DNA 的方法回收質粒并進行酶切鑒定，如果DNA 量太少則需重提質粒。 用QIAprep Miniprep Spin 小量提質粒注意以下事項可提高得率A．用含抗生素的培養基培養細菌會有較高的得率。B．收菌時用tips吸干凈殘余的
分子生物學實驗小技術（二）
1 、 各供應商送貨時往往會提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或將幾個化凍后的小冰袋填料塞入一個小泡沫盒中壓實，再插入各種大小的試管，放在-20 攝氏度下凍24小時后取出，拔出插入的廢管（可加點熱水以助拔管）即可做成一個
一些分子生物學實驗小技術2
5．有關融合蛋白表達載體的克隆 在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean
一些分子生物學實驗小技術匯編
1．保存菌種保存菌種或長時間放置的培養板應先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質粒則應加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時，按0.1%-0.5% 比例轉種，培養基的量不應超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測菌密度時，讀數值在0.1-0.
一些分子生物學實驗小技術1
1．保存菌種保存菌種或長時間放置的培養板應先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質粒則應加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時，按0.1%-0.5% 比例轉種，培養基的量不應超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測菌密度時，讀數值在0.
分子生物學實驗診斷技術
一、酸雜交技術檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復雜的物體中，使無法感覺的特定物質進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成本高外，關鍵是操作
分子生物學實驗診斷技術
一、酸雜交技術檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復雜的物體中，使無法感覺的特定物質進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成本高外，關鍵是操作
分子生物學實驗診斷技術（二）
（三）Northern blot用于RNA分析，電泳條件與轉膜方法與Southern blot不同外，RNA不必變性與中和，電泳時加電醛防止RNA發夾結構形成。其它步驟相同。為了防止RNase水解需分析的mRNA，盡可能將器皿在160-180℃干熱滅菌8小時以上，也可加0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC
分子生物學實驗診斷技術（一）
一、核酸雜交技術????? ? 檢驗方法建立的基本要素是特異性和靈敏度，在復雜的物體中，使無法感覺的特定物質進入人類的觀察范圍。核酸雜交檢測技術就是利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。該法建立以來已有二十年，目前研究實驗室用得多，臨床實驗室用得較少，除成
分子生物學常用實驗技術（五）
第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第一節概述 從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA 的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA 和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA 文庫,構建的cDNA 文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA 和相
分子生物學常用實驗技術（十六）
（三）電泳：1、預電泳（1）當凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE 緩沖液。（3）稀釋10×TBE 緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳
分子生物學常用實驗技術（七）
（四） 電泳分析 通常合成的cDNA 第一鏈和第二鏈長度為350-6000 堿基,需進行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的9-12 步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。1. 標準分子量DNA 參照物的同位素標記(1) 通常
分子生物學常用實驗技術（二）
第三節操作步驟 一、細菌的培養和收集 將含有質粒pBS 的DH5α菌種接種在LB 固體培養基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培養12-24 小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB 液體培養基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養約12 小時至對數生長后期。 二、質粒D
分子生物學常用實驗技術（十七）
第二節T7 DN A 聚合酶測序技術一、概述 T7 DNA 聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA 聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又稱T7
分子生物學常用實驗技術（十八）
五、操作步驟：（一）、模板制備1、M13 單鏈模板制備：在轉化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG 的培養基上鋪板之后, 含有M13 重組子的細胞將表現出無色的"噬菌斑"，事實上受感染的細胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現噬菌斑是因為被感染的細菌在生長速度上比其周圍未感染的
分子生物學常用實驗技術（一）
第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定第二章DNA 酶切及凝膠電泳第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化第四章RNA 的提取和cDNA 合成第五章重組質粒的連接、轉化及篩選第六章基因組DNA 的提取第七章RFLP 和RAPD 技術第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆第九章分子雜交技術第十章測
分子生物學常用實驗技術（四）
第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化第一節概述 在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob 基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外
分子生物學常用實驗技術（十四）
三、菌落原位雜交 對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針
分子生物學常用實驗技術（十二）
第九章分子雜交技術 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總D
分子生物學常用實驗技術（三）
第二章DNA 酶切及凝膠電泳第一節概述一. DNA 的限制性內切酶酶切分析 限制性內切酶能特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA 序列之內或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP 的存在。Ⅰ類酶結
分子生物學常用實驗技術（六）
一、材料 提純TMV 病毒液（10mg/ml）。二、設備 冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑 TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 緩沖液，無RNA 酶的雙菌水。四、操作步驟1、取一eppendorf 管加入提純
分子生物學常用實驗技術（八）
第五章重組質粒的連接、轉化及篩選第一節概述 質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得
分子生物學常用實驗技術（十五）
第十章測序技術 在分子生物學研究中，DNA 的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger 等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam 和Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨
分子生物學常用實驗技術（十三）
2. 從RNA 合成單鏈cDNA 探針cDNA 單鏈探針主要用來分離cDNA 文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA 探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT 為引物合成cDNA 探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產生的探針極大多數偏向于mRNA 3'末端序列
分子生物學常用實驗技術（十）
第二節RFLP 技術一、材料 基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。二、設備 電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4 塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf 管(0.5ml)若干。三、試劑：1、限制性內切酶(BamHⅠ, Ec
分子生物學常用實驗技術（九）
第三節從動物組織提取基因組DNA一、材料 哺乳動物新鮮組織。二、設備 移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。三、試劑1、分離緩沖液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶K (20mg/
分子生物學常用實驗技術（十一）
第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆第一節概述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA 或RNA 的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94℃下解鏈; (2) 退火
分子生物學常用實驗技術（page－1)
第一章質粒DNA 的分離、純化和鑒定 第二章DNA 酶切及凝膠電泳 第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化 第四章RNA 的提取和cDNA 合成 第五章重組質粒的連接、轉化及篩選 第六章基因組DNA 的提取 第七章RFLP 和RAPD 技術 第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆 第九章分
分子生物學常用實驗技術（page－3)
分子雜交技術 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DN
分子生物學常用實驗技術（page－2)
一、RNA 制備 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人